(整理)冻干工艺研究汇.

一、冷冻干燥过程研究

真空冷冻干燥是先将制品冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸气。再用真空系统的冷凝器(水汽凝结器)将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品的技术。该过程主要可分为：制品准备、预冻、一次干燥（升华干燥）、二次干燥（解吸干燥）和密封保存五个步骤。

1 产品预冻

1.1 制品的玻璃化

玻璃化的作用。近年来，人们已经逐渐地认识到，凡是成功的低温保存，细胞内的水均以玻璃态的形式被固化，在胞内不出现晶态的冰。玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，分子的能动性几乎为零，由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性。

玻璃化的获得。在产品预冻时，只要降温速率足够快，且达到足够低的温度，大部分材料都能从液体过冷到玻璃态固体。“足够快”的意思是在降温过程中迅速通过结晶区而不发生晶化，“足够低”指的是必须把温度降到玻璃化转变温度Tg以下。

对于具有一定初始浓度的细菌制品，其预冻过程一般通过“两步法”来完成。第一步是以一般速率进行降温，让细胞外的溶液中产生冰，细胞内的水分通过细胞膜渗向胞外，胞内溶液的浓度逐渐提高；第二步是以较高速率进行降温，以实现胞内溶液的玻璃化。此法又称“部分玻璃化法”。

当初始浓度为A的溶液（A点）从室温开始冷却时，随着温度的下降，溶液过冷到B点后将开始析出冰，结晶潜热的释放又使溶液局部温度升高。溶液将沿着平衡的熔融线不断析出冰晶，冰晶周围剩余的未冻溶液随温度下降，浓度不断升高，一直下降到熔融线(Ta)与玻璃化转变曲线(Tg)的交点(D点)时，溶液中剩余的水分将不再结晶(称为不可冻水)，此时的溶液达到最大冻结浓缩状，浓度较高，以非晶态的形式包围在冰晶周围，形成镶嵌着冰晶的玻璃体。

1.2降温速率与预冻温度

预冻速度决定了制品体积大小、形状和成品最初晶格及其微孔的特性，其速度可控制在每分钟降温1℃左右。

对结晶性制剂而言，冻结速度一般不要太慢，冻结速度慢虽然便于形成大块冰晶体，维持通畅的升华通道，使升华速度加快，但如果结晶过大、晶核数量过少、制剂的结晶均匀性差，也不利于升华干燥。对于一些分子呈无规则网状结构的高分子药物，速冻能使其在药液中迅速定型，使包裹在其中的溶媒蒸汽在真空条件下迅速逸出，反而能使升华速度加快。因此，溶液的最佳冷冻速度是因制剂本身的特性不同而变化的。如蛋白多肽类药物的冻干，慢速冻结通常是有利的，而对于病毒、疫苗来说，快速降温通常是有利的。20世纪60年代，人们成功地保存了哺乳动物的某些细胞，其降温程序是：以1℃/min

降到-15℃，然后以4-5℃/min降到-79℃，这一程序与前面所提及的“两步法”是一致的。但也有降温更慢和更快的事例，如红细胞和仓鼠细胞的最佳冷却速率超过50℃/min，而保存淋巴细胞的降温速率只有0.1℃/min。

预冻温度须低于制品的玻璃态和橡胶态转变温度，以保证箱内所有的制品温度都低于共熔点，使其全部凝结成固体；对于许多溶液，它们的玻璃化转变温度一般要比共晶点低10-30°。至于预冻的最终温度是控制在低于共晶温度还是低于玻璃化转变温度，这主要取决于我们希望制品在冻结过程中所达到的固化状态。对于具有类似膜结构或活性成分制品的冷冻干燥，应尽量使其最终冻结温度低于玻璃化转变温度。一般制品预冻温度在共熔点以下10-20℃保持2-3h，保证冷冻完全；多数疫苗的共熔点在-15℃到-20℃之间，因此预冻温度要在-25℃到-40℃。目前最常用的一种冷冻方法是冻干机板层冷冻。

2一次干燥

一次干燥（升华干燥）是指低温下对制品加热，同时用真空泵抽真空，使其中被冻结成冰的自由水直接升华成水蒸气。待成品中看不到冰时，则可认为一次干燥已完毕，此时制品温度迅速上升，接近板温，制品中最初水分的90%以上已被除去。

2.1一次干燥中制品温度的控制

在升华干燥过程中，制品吸收热量后所含水分在真空下升华成水蒸气，消耗大量热能，使得制品温度较板层温度低十几甚至几十度。多数动物用疫苗一次干燥应在-30℃或以上温度（低于产品塌陷温度尤其是共熔点温度）下进行，因此板层温度一般在-10～-3℃之间。如果温度过高，会出现软化、塌陷等现象，造成冻干失败；如果温度过低，不仅给制冷系统提出了过高的要求，而且大大降低了升华过程的速率，费时又耗能。尽管在有些场合下，一次干燥的最大许可温度由制品的相变温度或共晶温度决定，但更一般的情况下，预冻的制品中都有一定份额的无定形态，故应当将冻干的一次干燥过程控制在Tg以下进行。

在干燥过程中，如制品干燥层温度上升到一定数值时，其部分干燥物质所形成的多孔性骨架刚度降低，干燥层内颗粒出现脱落，直至骨架塌陷，造成已被干燥部分的微孔通道被封闭，阻止升华的进行，使升华速率减慢，最终可导致冻干产品的残余水分含量过高，产品的复水性与稳定性差。此时的温度称为塌陷温度Tc。塌陷温度Tc是在冻干过程中样品所特有的特征温度，是由制品材料及干燥层的多孔性结构所决定。有人认为，在多数情况下，塌陷温度Tc要比玻璃化转变温度Tg高20°左右。对于一个特定的冻干制品，其共晶温度、玻璃化转变温度可通过DSC（差式扫描量热法）测得，而塌陷温度可通过冻干显微镜和介电分析测得。

目前大多数的操作，都是在整个升华干燥过程中保持加热温度不变。关于是否应当这样，存在两种不同的观点。一种观点认为，在升华干燥阶段，随着水分的升华，使制品浓度升高，其玻璃化转变温度也会提高，这样升华干燥过程中就可以适当逐渐提高温度，加快升华进行；另一种观点认为，在升华干燥阶段，升华的只是游离在网状结构空隙中的自由水，不会对物料实体的玻璃化转变温度产生影响，

因此升华干燥过程中的加热温度仍应保持不变。实际上这两种情况都可能出现，是和冷却固化的情况有关的。

2.2一次干燥中冷阱温度的控制

冷阱位于真空泵进口前，升华产生的水蒸气靠压差的作用到达冷阱，重新结成霜，如果没有冷阱或其温度不够低，就会导致冻干室内水蒸汽压升高，制品升华界面压力和温度都会上升，导致制品融化。对于多数制品的冷冻干燥，冷阱表面温度在-40—-50℃之间已能满足要求。

2.3一次干燥中的真空度

一次干燥中真空度应维持13.33-26.66pa。一般说来，在升华干燥过程中真空度是维持不变的，但也可以采用循环压力法，即控制真空系统的压力在一定范围内上下波动，以期提高干燥速度。大量研究表明，在干燥过程中短期地略微提高干燥室压力（10-20Pa），同时干燥层表面温度维持在接近其允许值，可以缩短干燥时间。但干燥室压力必须低于升华界面压力，而升华界面的压力所对应的升华界面温度必须低于制品在相应浓度下的玻璃化转变温度。在升华过程中，有时可采用向冻干箱内充注气体，以形成对流传热，但这一部分空气量会降低真空度，因此，要对真空度进行控制，使其既能形成恰当的对流传热，又能使制剂表面始终处于匀速干燥的压力状态。

2.4影响干燥效率的因素

在一次干燥过程中，除了制品温度、冷阱温度、干燥室压力影响干燥快慢以外，预冻速度也影响着升华效率。慢冻形成大冰晶，升华后形成大的孔隙，有利于升华进行，干燥速度快；速冻形成细小的冰晶，升华后留下细小的通道，干燥速度慢。但慢冻时，溶质可能发生迁移，以至于在表面形成一层硬壳，阻止升华进行。

近年来发现，在冻干配方中加入5%左右叔丁醇后，冻结时会形成针状结晶，冰晶升华后留下了管状通道，使水蒸气阻力大大减小，升华速率显著提高，节省了时间和能耗。

3 二次干燥

二次干燥（解吸干燥）是在较高的温度下对制品加热，使制品中被吸附的部分“束缚水”解吸变成“自由”的液态水再吸热蒸发成水蒸气的过程，加热量主要用于被束缚水的解吸作用和蒸发。由于升华干燥之后，在干燥制品的多孔结构表面和极性集团上结合水的吸附能量很大，因此必须提供较高的温度和足够的热量才能实现结合水的解吸过程。该过程中，制品的含水量不断减少，其玻璃化转变温度是不断提高的，制品温度也可以逐渐提高。

在二次干燥过程中，板层温度至少每小时增加5℃-10℃。成品温度应该迅速升至板层温度或以上，否则制品水分增多且易倒塌。

二次干燥目的虽然是使残存在多孔疏松状固体中的水被去除，但适当的水分（通常1-1.5%）对于保持疫苗结构完整性和活性也是必要的。制品水分过低，菌体表面亲水基团失去保护，会直接与氧接触，影响菌体的存活率。最终板层温度是成品水分含量的一个主要决定因素，其数值不能超过制品的最高允许温度，对于蛋白质药物其最高允许温度一般应低于40℃，对于绝大多数动物用疫苗，最终板层温度

应该在25℃-35℃之间。一般细菌性产品最终板层温度为30℃-35℃，病毒性产品为25℃。

4 密封保存

冻干结束后，通过板层液压升降系统，将半加塞的疫苗瓶在真空状态下密封。使用的管状玻璃瓶和胶塞应配套，将其密封后置45℃水浴24小时，观察疫苗瓶中是否有水被吸入。真空密封的完整性应在温度压力下评估，简单的试验是将成品在45℃水浴24小时，观察疫苗瓶中是否有水被吸入。胶塞应该在135℃干燥4小时，高压灭菌胶塞可使疫苗的水分提高2-5%。

二、叔丁醇在冻干制剂中的应用研究

冷冻干燥工艺已经被广泛地应用于药物制剂的制备过程中。通常情况下，水是惟一的溶剂，但有时候药物在萃取和结晶过程中残留的有机溶剂，也可能会被带入到最后的冻干溶液中，这样会导致一些新的变化，含少量有机溶剂的溶液的冻干工艺引起人们的关注，并被深入研究。叔丁醇-水共溶剂就是其中最常见的，以它为溶剂进行冷冻干燥的工艺可以用于多种制剂的制备，具有多方面优势。

由于叔丁醇作为冻干剂具有多重优势，已被广泛用于制剂中，纯的叔丁醇可以单独作为溶剂，溶解水不溶性药物或水中稳定性不好的药物，进行冻干。国内外研究较多是叔丁醇与水形成共溶剂体系进行冷冻干燥，其在药剂领域中应用有多方面。

■制备固体制剂具明显优势

难溶于水的药物溶于叔丁醇中，水溶性物质溶解于水中，两者以适当的比例混合，得到可以共同溶解水溶性与脂溶性物质的澄明共溶剂，此溶液经进一步冻干可以得到固体分散体。采用这种工艺制备药剂具有多种好处。

加快药物的升华速度研究发现，将溶解庆大霉素的叔丁醇溶液与乳糖水溶液以合适的比例混合形成共溶剂后冻干，其冻干周期可由39小时缩短为28小时，同时所得冻干产品仍保持多孔性。

提高药物的稳定性前列腺素E为稳定性很差的药物，采用体积分数为20%的叔丁醇-水共溶剂将药物和乳糖共同溶解，冻干后得到稳定冻干粉针。目前，采用此冻干工艺生产的前列腺素E无菌粉末制剂已在国外上市。

增溶难溶性药物Aldipine是一种从海洋生物中提取的抗癌活性物质，其相对分子质量为1109，在水中几乎不溶。研究人员探索到一种新的增溶方法：将药物先溶于叔丁醇中，再与乳糖水溶液按体积比4∶6的比例形成澄明共溶剂，进行冻干，得到稳定的冻干物，使用前采用聚氧乙烯蓖麻油-乙醇-水共溶剂系统来复溶，生理盐水稀释后注射给药。

简化制备固体分散体工艺最近，研究人员将脂溶性药物连同水溶性寡糖共溶于叔丁醇-水共溶剂体系，冻干后制成固体分散体。采用此方法可以将脂溶性药物分散在一些玻璃化温度较高的无定型辅料中，使药物保持在无定型状态，可显著提高药物的溶解速度和药物的溶解度。这种工艺可以避免用熔融法制备固体分散体对热稳定性差的药物的破坏，也能避免采用溶剂法制备固体分散体时使用氯仿、二氯甲烷

等毒性较大的溶剂。

促进药物结晶叔丁醇-水共溶剂体系制备固体分散体可以使药物保持在无定型状态。另一方面，叔丁醇也可用来促进难结晶药物的结晶。这是因为，叔丁醇的加入会改变水的结晶状态，进而也会使溶在水中的药物结晶状态发生改变。对抗生素头孢噻吩钠的研究发现，加入少量的叔丁醇可以使很难结晶的药物得到针状的结晶。磷霉素钠属难冻结的物质，因为药物和水的结合力很强，形成水合物的凝固点急剧下降到零下50℃左右，普通的冻干机很难将其冻结，同时很低的温度也使药物的冻干周期大大延长。而加入叔丁醇后，由于叔丁醇与水的结合力较强，使得共溶剂系统的凝固点升高，同时大大地提高了升华速度。

■制备多种分散体系

制备脂质体以叔丁醇作为溶剂溶解磷脂，经冻干后得到结构疏松的磷脂固体，加入水可以迅速水化制成脂质体。这种方法类似薄膜分散法，可以制得粒径较大的微米级多室脂质体，这种脂质体制备工艺已经应用于试验和规模生产。

最近，沈阳药科大学的科研人员发明了一种新的脂质体制备工艺，即将相变温度低的大豆磷脂溶于叔丁醇，进一步与蔗糖水溶液按适当比例混合，得到澄明溶液，冻干得到固体分散体，加水水化，即可得到粒径均匀的小单室脂质体。该工艺解决了脂质体稳定性不好的问题，建立了一个形成小单室脂质体的模型。在冻干过程中，磷脂的叔丁醇溶液先析出结晶，这种结晶的形成被黏度较大的糖溶液限制，只能形成较小的粒径。同时，在析出结晶这个相分离的过程中，磷脂作为一种表面活性剂，吸附在两相的界面上，降低表面张力，即磷脂包裹的叔丁醇分散在糖基质中，最终形成一种类似乳剂的状态。吸附在两相界面的磷脂在冻干过程中随叔丁醇升华，形成定向排列磷脂双分子层片断，由于双分子片断足够小，水化后形成了小单室的脂质体。

研究人员针对相变温度高的饱和磷脂，设计了另一种工艺，即将其溶于叔丁醇，在实验温度大于相变温度时注入到水中，形成脂质体，再进行冻干得到冻干脂质体。此方法可缩短冻干周期。

研究证明，将饱和磷脂DMPC-DMPG(摩尔比为7∶3)与蒽环类抗癌药Annamycin以质量比50∶1的比例溶于叔丁醇-二甲基亚砜-水共溶剂体系，并加入表面活性剂吐温-80，冷冻干燥制成冻干粉末，水化后也可得到亚微米级的脂质体。

制备非离子表面活性剂囊泡磷脂以外的一些非离子表面活性剂，也可以与水溶性介质共溶于叔丁醇-水体系，冷冻干燥得到冻干分散体，水化后得到非离子表面活性剂囊泡。

制备高聚物胶团一些高分子共聚物可以与脂溶性药物形成胶团，增加药物在水中的溶解度。通常的做法是，将高分子共聚物和药物共溶于水中，此法对于很多水溶性差的药物来说，会造成载药量减少，并且由于高分子材料自身的水溶性较差，很多时候需要将两者共同溶于有机溶剂中，然后用水透析出去。还有一种方法是形成水包油的乳剂再除去有机溶剂。这些方法都比较复杂且不经济。最近，有人将叔丁醇-水的系统引入到高聚物胶团的制备过程中，制备了紫杉醇和多烯紫杉醇的高分子胶团，取得较好效果。其方法是将药物与高分子共溶制备澄明溶液，冻干后的固体分散物加水水化后即得到小于100纳米

的胶团。此工艺简单、方便，效果好，并且，叔丁醇-水共溶剂还可以回收利用，增加了大量生产的可行性。

■改进制剂工艺路线

由于叔丁醇-水共溶剂体系可以将水溶性和脂溶性的物质共同溶解在一起，溶剂可以在冻干后除去。因此，可以采用此方法对很多制剂的制备工艺进行改进。

蛋白质肽类的口服给药一直是当前研究的热点与难点。叔丁醇-水共溶剂系统为水溶性的蛋白质-多肽溶于油溶液提供了一种新的药物传递办法。研究人员采用叔丁醇-水共溶剂体系，冷冻干燥制备含有蛋白质-多肽的磷脂分散体，将这种冻干分散体溶于油溶液中，制成包裹水溶性蛋白质-多肽的反胶团油溶液。为了解决难溶性药物在水中的溶解度，通常采用环糊精包合技术。常规冷冻干燥采用乙醇为溶剂溶解难溶性药物，由于乙醇的溶解能力有限，通常需要使用较多的溶剂，并且含乙醇的共溶剂体系不易冻结，冷冻干燥效果不好。于是，研究人员将药物与环糊精溶于叔丁醇-水共溶剂系统，冷冻干燥一步制备形成包合物。由于叔丁醇溶解难溶性药物的能力强于乙醇，且冻结完全，干燥迅速，此方法提供了一种方便的制备环糊精包合物的新工艺。

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叔丁醇作为冻干剂的特点

目前，在室温条件下可以冻结的有机溶剂主要有4种：叔丁醇、冰醋酸、环己烷和二甲基亚砜。其中，叔丁醇被认为是最适合制剂的冻干溶剂。其特点如下：

1、凝固点高。纯的叔丁醇在室温下（25℃）就可以冻结，与水混合后也可以在零下几度冻结，在现有的冻干机中都可以完全冻结。

2、叔丁醇的蒸汽压较高。蒸汽压高有利于升华，节省冻干时间。

3、叔丁醇与水可以任意比例混合。这一点极为重要，可以增大一些脂溶性药物在水中的溶解度，同时对一些水溶液中不稳定的药物，加入适量的叔丁醇可以抑制药物的分解，增强药物的稳定性。

4、叔丁醇毒性低。在冻干过程中，大部分叔丁醇可在一次干燥阶段升华，在制剂中残留量很低。

5、叔丁醇自身在冻结中形成针状结晶，能改变溶质的结晶方式，利于升华。而当少量的叔丁醇加入到水中形成叔丁醇-水共溶剂后，可以改变水的结晶状态，在冻结过程中形成针状结晶，具有大的表面积,同时冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸气流动阻力大大减小，升华速率显著提高，因此可用叔丁醇来加快冷冻干燥过程中的传质过程。

6、叔丁醇作为冻干溶剂的优点很多，但叔丁醇的纯度以及叔丁醇作为有机溶剂的生产安全性和回收利用问题均需引起生产者注意。

三、蛋白质药品冷冻干燥技术研究

1 引言

由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。从国家药品监督管理局数据库得知，目前国内已有注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、注射用重组人干扰素α2b、冻干鼠表皮生长因子、外用冻干重组人表皮生长因子、注射用重组链激酶、注射用重组人白介素-2、注射用重组人生长激素、注射用A群链球菌、注射用重组人干扰素α2b、冻干人凝血因子VⅢ、冻干人纤维蛋白原、间苯三酚口服冻干片等冻干药品获准上市。截止2000年2月，美国FDA已批准的生物技术药共计76个。

2 药品冻干损伤和保护机理

药品冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使药品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。其中冻结应力又可分为枝状冰晶的形成，离子浓度的增加，PH值的改变和相分离等情况。

因此，为了保护药品的活性，通常在药品配方中添加活性物质的保护剂。它需要具备四个特性：玻璃化转变温度高、吸水性差、结晶率低和不含还原基。

常用的保护剂有如下几类物质：

a) 糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；

b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；

c) 无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等；

d) 表面活性剂：Tween 80等；

e) 氨基酸：L-丝氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；

f) 盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等；

由于冷冻干燥过程存在多种应力损伤，因此保护剂保护药品活性的机理也是不同的，可以分为低温保护和冻干保护。

对于低温保护，目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳定的机理之一是优先作用原理。优先作用是指蛋白质优先与水或水溶液中的保护剂作用。在有起稳定作用的保护剂存在的条件下，蛋白质优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。在这种情况下，蛋白质表面就比其内部有较多的水分子和较少的保护剂分子。优先作用原理同样适用于冷冻-融解过程。蛋白质保护剂，在溶液中被从蛋白质表面排斥，在冻结过程中能够稳定蛋白质。但是优先作用机理不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。

在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中，目前主要有两种：

a) 水替代假说。许多研究者认为由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。

b) 玻璃态假说。研究者认为在含保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂-水混合物就会玻璃化。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，粘度极高，不容易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的链段运动受阻，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。

目前大部分学者赞同"水替代假说"，因为可以通过实验检测到蛋白质和保护剂之间的氢键，为理论提供证据。事实上，无论是"水替代假说"还是"玻璃态假说"，它们的基础都是基于药液实现了部分或全部玻璃化冻结。

4 冻干工艺及优化

由于药品冷冻干燥过程会产生多种应力，对冻干药品的药性有很大的影响，因此对药品冷冻干燥过程进行合理设计，对于减少冻干损伤和提高冻干药品的质量有重大的意义。

4.1冻结研究

冷冻干燥过程中的冻结过程非常重要，因为在冻结中形成的冰晶形态和大小以及玻璃化程度不仅影响后继的干燥速率，而且影响冻干药品的质量。因此在冻结过程中必须考虑配方、冻结速率、冻结方式、以及是否退火等问题。

4.1.1 配方的影响

配方中的固体含量会影响冻结和干燥过程。如果固体含量少于2%，那么冻干药品结构的机械性能就会不稳定。尤其在干燥过程中，药品微粒不能粘在基质上，逸出的水蒸气会把这些微粒带到小瓶的塞子上，有时甚至会带到真空室当中。

此外，为了获得均匀一致、表面光滑、稳定的蛋白质药品，配方中必须含有填充剂、赋形剂、稳定剂等保护剂，这些保护剂对实现药品的玻璃化冻结有重大的影响。很多糖类或多元醇经常被用于溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质的稳定剂，它们既是有效的低温保护剂又是很好的冻干保护剂，它们对冻结的影响取决于种类和浓度。文献对不同的保护剂进行了详尽的研究，探讨了它们的冻结特性。文献还研究了其它保护剂的冻结特性。但是蛋白质种类很多，而且物理化学性质各异，因此不同的蛋白质需要不同的保护剂配方，因此它们的冻结特性就不同，一般需要实验。

4.1.2 冻结方式

冻结方式不同，产生的冰晶的形态和大小就不同，而且会影响后继的干燥速率和冻干药品质量。根据冻结机理，可以把冻结分为全域过冷结晶和定向结晶两类。

全域过冷结晶是指全部药液处于相同或相近的过冷度下进行冻结的方式。在全域过冷结晶中，冻结速率和冰晶成核温度是重要的参数。

全域过冷结晶按冻结速率的快慢可分为慢速冻结和快速冻结。快速冻结的冰晶细小，而且没有冻结浓缩现象，但是存在不完全冻结现象。相反，慢速冷却产生较大的冰晶，并且存在冻结浓缩的现象。Thomas W Patapoff等人发现如果把药品直接浸入液氮或干冰-乙醇溶液槽中（快速冻结），那么晶核首先在瓶壁产生，然后冰晶向中心扩散，再垂直向上扩散。由于长成的冰晶细小，而且有水平方向的结构，导致干燥阶段的传质阻力很大，升华速率降低。实验证明，快速冻结导致升华速率低，解吸速率快，慢速冻结导致升华速率快，解吸速率慢。

James A Searles等人认为冰晶成核温度是全域过冷结晶的重要因素，因为它是升华速率的主要决定因素。他们在研究中发现，冰晶成核温度从本质上来说是随机的、不稳定的，不容易控制，但是受溶液中的微粒含量和是否存在冰晶成核体等影响因素。正是冰晶成核温度的随机性导致升华干燥速率的不均匀性以及与形态相关的参数，如冻干药品表面积和解吸干燥速率。

定向结晶是指一小部分药液处于过冷状态下进行冻结的方式。Thomas W Patapoff介绍了一种垂直冻结方式。溶液用湿冰冷却，在瓶子底部用干冰冷却，形成晶核，然后放到-50℃的搁板上冻结。用这种方式冻结的样品的冰晶在垂直方向呈现烟囱状，在药品表面没有冻结浓缩层，而且整个药品的结构均一性很好，因此在干燥时的传质阻力很小，加快了冻干速率。Martin Kramer等人采用了另外一种方式实现了定向冻结。他们在真空室压力为0.1kPa，搁板温度为+10℃的条件下，让溶液开始表面冻结，形成1～3mm左右的冰晶薄层。然后解除真空，降低搁板温度到结晶温度以下进行冻结。在这种条件下长成的冰晶粗大，也呈烟囱状。同时在干燥阶段发现，升华干燥时间比采用一般冻结的时间节省了20%。分析冻干药品时还发现，对甘露醇，采用这种方式冻结的冻干品的剩余含水量比采用一般冻结的要多；但对蔗糖和甘氨酸，两者差别不大。H Schoof等人在冻干胶原质时也采用了定向结晶的方式。

冻结方式不同，产生的冰晶形态和大小就不同，后继的干燥速率也不同。实验证明，采用定向结晶方式的冻结药品的干燥速率比全域过冷结晶的快。但是无论采用哪种冻结方式，药品溶液必须部分或全部实现玻璃化冻结，以保护药品药性。

4.1.3 退火

退火是指把冻结药品温度升到共熔温度以下，保温一段时间，然后再降低温度到冻结温度的过程。在升华干燥之前增加退火步骤，至少有三个原因：

a) 强化结晶。在冻结过程特别是快速冻结过程中，配方中结晶成分往往来不及完全结晶。但是如果该成分能为冻干药品结构提供必要的支撑或者蛋白质在该成分完全结晶后会更稳定，那么就有必要完全结晶。此外，冻结浓缩液中也会有一部分水来不及析出，使其达不到最大浓缩状态。实验证明，当退火的温度高于配方的最大浓缩液玻璃化转变温度Tg'时，会促进再结晶的形成使结晶成分和未冻结水结晶完全。

b) 提高非晶相的最大浓缩液玻璃化转变温度Tg'。从非晶相中除去Tg'较低的结晶成分，能够提高

非晶相的Tg'。Barry J Aldous在研究非晶态碳水化合物的水合物结晶规律时发现，经过退火之后的海藻糖干燥溶液的玻璃化转变温度由31℃上升到79℃，大大提高了稳定作用。

c) 改变冰晶形态和大小分布，提高干燥效率。James A Searles等人研究认为不同的成核温度产生不同的冰晶形态和粒径大小，继而导致升华干燥的速率的不均匀。但是一个过程中的干燥速率是由最慢的干燥药品确定的，因此不均匀的干燥速率会影响药品的质量和生产的经济性。研究证实退火过程中的相行为和重结晶可以减小由于成核温度差异造成的冰晶尺寸差异及干燥速率的不均匀性，提高干燥效率和药品均匀性。

为了达到退火目的，在退火操作中，必须考虑加热速率、退火温度、退火时间等参数。但是目前由于实验手段不够先进和理论知识比较缺乏，退火机理尚有疑问，退火参数的选取仍然没有依据。

4.2 干燥

药品冷冻干燥的干燥过程可以分为两个阶段，一次干燥和二次干燥。在一次干燥阶段除去自由水，在二次干燥阶段除去部分结合水。干燥过程占据了药品冷冻干燥过程的大部分能耗，因此采取有效措施提高干燥速率显得非常有意义。目前，大都采取控制搁板和药品温度、冷阱温度和真空度的做法来实现干燥速率的提高。

药品温度的控制：包括冻结层和已干层的温度控制。控制冻结层温度的原则是在保证冻结层不发生熔化（在低共熔点以下）的前提下，温度越高越好。控制已干层温度的原则是在不使物料变性或已干层结构崩塌的前提下、尽量采用较高的干燥温度。而搁板温度的控制是以满足药品温度控制为标准。

冷阱温度：冻干过程中水升华的驱动力是药品和冷阱间的温差。由于药品温度受加热方式的限制，同时不能高于共熔温度，因此冷阱温度越低越好。为了提高经济性，在升华干燥过程中应至少低于药品温度20℃；在解吸干燥过程中，对于那些要求很低残余水分的配方，冷阱温度要求更低。

真空度：一般认为，压力对冻干过程有正反两方面的影响：

a) 在药品共熔点温度和崩塌温度以下，升华界面温度越高，升华水汽越多，所需热量越大。压力越高，相应提高了已干层导热系数，表面对流作用也越大，因此升华水汽也越快，即冻干速率越大。

b) 升华界面通过已干层到外部的水汽逸出速度与界面和表面之间的压力差，即界面温度所对应的饱和压力与干燥室的真空度之差相关。这个压差大，有助于水汽逸出。这个压差越小，逸出越慢，干燥速率也越小。如果冷冻干燥是传热控制过程，则干燥速率随着干燥室压力升高而提高；如果冷冻干燥是传质控制过程，干燥速率随着干燥室压力升高而降低。

经验证明升华阶段的真空度在10～30Pa时，既有利于热量的传递，又利于升华的进行。若压强过低，则对传热不利，药品不易获得热量，升华速率反而降低，而且对设备的要求也更高，增加了成本。而当压强过高时，药品内冰的升华速度减慢，药品吸收热量将减少，于是药品自身的温度上升，当高于共熔点温度时，药品将发生熔化导致冻干失败。根据真空度对冻干速率的影响，文献采用了循环压力法，得到了不错的效果。

药品冷冻干燥过程是一个连续的操作，不同的药品配方，有不同的冻结特性，而且冻干曲线也不同，

因此应在基础研究的基础上广泛开展个体研究，优化冻干曲线，提高干燥速率，降低能耗。

耐热冻干保护剂在疫苗生产中的应用研究

冻干保护剂可影响生物制品的质量、效价和稳定性，改变生物制品的生产工艺，提高产品干燥能力并增大产品批次间的稳定性。耐热冻干保护剂有免疫活性但无药理活性，可在冻干和保存时维持疫苗的稳定性，初次干燥时在适宜的温度下疫苗不倒塌，企业低成本即可获取。

一、分类

（一）按相对分子量分

按相对分子量分可分为低分子化合物和高分子化合物。

1.低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用。如：

酸性物质：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸；

中性物质：葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇；

碱性物质：精氨酸、组氨酸。

2.高分子化合物高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。如：白蛋白、明胶、蛋白胨、脱脂奶粉。

水解明胶水解明胶可去掉杂质蛋白、无抗原性、无过敏反应、无热源，并且分子量小、均质、易溶于水，可过滤除菌，共熔点为-12℃。对微生物的保护作用高出普通明胶10％以上。

脱脂奶粉可促进升华、加热灭菌，易取得均质产品，并扩大细胞相互间的距离。

(二)按功能和性质分

1.耐热冻干保护剂耐热冻干保护剂在冻结和干燥过程中，可防止活性组分变性，如海藻糖、蔗糖、聚维酮（PVP）等。

2.填充剂可防止有效组分随水蒸气一起升华逸散，如：甘露醇、明胶等。

3.抗氧化剂产品的自身氧化可消耗冻干样品内部和环境中的氧；放入电子或氢离子，可阻断冻干样品中氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。如硫代硫酸钠、维生素E、维生素C等。

4.酸碱调整剂在冷冻干燥、储藏过程中，将生物制品PH值调整到活性物质最稳定区域。常用的有：磷酸二氢钾、磷酸氢钠。

（三）按物质的种类分

1.糖/多元醇类单糖（葡萄糖、半乳糖）：糖与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置，起保护作用；

低聚糖（蔗糖、海藻糖）：低聚糖能起到低温保护功能和脱水保护作用；海藻糖则具有相对较高的玻璃化转变温度。海藻糖—蛋白质—水微冰晶的形成，有效防止了水对玻璃化态的增塑作用。并且其内

部氢键较少，有利于蛋白质分子间形成氢键。

多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）:多元醇具有和糖一样的作用。甘露醇无菌滤液稳定，不易被氧化，可提供支持结构，并且不与活性组分发生反应；山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比甘露醇大，在常温下呈粘稠的透明状液体，有旋光性，略有甜味，具有吸湿性，高温下不稳定，在冷冻干燥配方中，山梨醇常用作填充剂。

2.表面活性剂类表面活性剂是降低界面的张力，亲水、亲油基组成的化合物。表面活性剂可分为离子型、非离子型。凡是溶于水能电离成离子的，称为离子型表面活性剂，否则称为非离子型表面活性剂。表面活性剂在冻结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂作用。但在冻干生物制品测定和长期储藏中，表面活性剂并没有保护作用。

3.氨基酸类氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸类保护剂有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸，试验表明氨基酸是最好的填充剂。

低浓度甘氨酸可通过抑制10或100mmol/L磷酸缓冲盐结晶所致PH值的改变而阻止蛋白质药物变性，并且能升高成品的塌陷（崩解）温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏。

4.其它添加剂类其它添加剂类保护剂包括抗氧化剂、缓冲剂和冻干加速剂。

抗氧化剂：一种是抗氧化剂的自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使冻干样品物料不被氧化；另一种使抗氧化剂给出电子或氢离子，阻断冻干样品中的氧化链式反应；还有一种方式是抗氧化剂通过抑制氧化的活性而防止冻干样品的氧化变质，如维生素E、维生素C、硫代硫酸钠、硫脲。

缓冲剂：蛋白质具有两性电解质，既能和酸作用又能和碱作用。在中性环境中，大多数蛋白质是稳定的，由于蛋白质溶液在冻结过程中溶液的浓度是逐渐升高的，所以在高浓度时可改变溶液的PH值，PH值变化4个单位导致蛋白质变性，使生物制品失活。因此在冻干保护剂配方中，需添加适量缓冲剂。如，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠。

冻干加速剂：冷冻干燥过程耗时长、耗能多，迫切需要对冻干循环进行优化，降低生产成本。叔丁醇是一种小分子醇，与水完全互溶，具有低毒性、高蒸汽压。在药品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：

可降低干燥层阻力，从而加速干燥过程，缩短干燥时间；对于难溶于水的药品，可使产品具有较高的比表面积、好的外观，并易于复水，提高药品溶液和冻干品的稳定性，且有一定的抑菌作用。

二、冻干保护剂的作用机理

（一）冻结过程中低温保护机理

“优先作用”机理认为，蛋白质溶液在达到最大冻结浓度之前，优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。这是由于保护剂的加入，增大了水分子的表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用。在这种情况下，蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子，从而也就保护了蛋白质的天然构象。

“优先作用”机理并不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。因此，

必然存在其他保护作用机理。表面张力减小的机理可以用于解释表面活性剂对蛋白质溶液冻结过程的保护。限制蛋白质分子扩散的机理认为，许多保护剂都能够提高溶液的粘度，抑制活性分子的扩散。

（二）干燥过程中的保护机理

玻璃态假说在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会形成玻璃态。玻璃态分为两种即：强玻璃和弱玻璃。

在玻璃化转变温度以下进行降温，弱玻璃粘度的增加，比强玻璃来的快。因此，赋形剂形成弱玻璃要比形成强玻璃的保护效果好得多。蔗糖和海藻糖就是因为能够形成一种弱玻璃而具有很好的保护作用。

水替代假说由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接。当蛋白质在冷冻干燥过程中推动水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。当冷冻干燥时，保护剂可与生物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大分子冻干损伤。

（三）储藏过程中的保护机理

干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时，而对于储藏而言，时间尺度为月或年。在正确的冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转变温度，而在正确的储藏条件下，环境温度应当比其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松驰时间。

三、耐热冻干保护剂配方需要注意的问题

确定最优的pH值生物制品中的活性成分（如蛋白质）只有在很小的PH值范围内才是稳定的，并且不同的PH环境会影响蛋白质的溶解性。最优的PH环境有利于蛋白质的稳定性和它在溶液中的溶解性，冷冻干燥配方的PH对冻干生物制品长期储藏的稳定性也会带来很大影响。另外，酸碱度会影响固体状态下蛋白质的物理和化学的稳定性。

缓冲剂的选择许多缓冲剂能够用于生物制品耐热保护剂配方中，但是并非每一种缓冲剂都能够用于任何溶液；对PH值敏感的蛋白质溶液，就应当避免使用磷酸钠缓冲液，这是由于在冻结过程中，Na2HPO4易于优先结晶，使得溶液的PH降低，最终引起蛋白质变性；正确选择缓冲剂的浓度也是很重要的。

填充剂的选择填充剂有相当好的溶解性，与生物制品中活性组分相容，没有或者只有很小的毒性，具有较高的共晶温度。

低温、干燥保护剂的选择糖类是生物制品冷冻干燥过程中使用最频繁的保护剂，一般不选用还原性糖，因为它可能与蛋白质之间发生非酶褐变反应；某些盐类也要用作生物制品在冷冻干燥过程中的

保护剂；某些聚合物，因其能提高玻璃化转变温度，而常被用作保护剂。但是，聚合物与蛋白质分子形成氢键的能力远远低于糖类，所以常常采用聚合物和糖联合使用，当然，这种方式并不是对每一种蛋白质都是有效的。

超滤技术应用于穿琥宁冻干粉针的研究

【关键词】超滤技术

【摘要】目的提高穿琥宁冻干粉针质量。方法采用“高纯度穿琥宁生产工艺”专利超滤技术生产穿琥宁冻干粉针并与其它厂家同类产品进行动物急性毒性试验比较。结果超滤技术生产的注射用穿琥宁ld50 明显高于其它厂家生产的同规格产品，单次静脉给药的ld50达到910mg/kg，而国家标准说明书中的ld50 为675mg/kg，文献资料报道穿琥宁注射剂的单次静脉给药的ld50为580～620mg/kg。结论超滤技术可以大大降低注射用穿琥宁产品的毒性，提高临床安全性。

注射用穿琥宁是采用爵床科植物穿心莲提取物―穿心莲内酯经酯化、脱水、成盐而制成的脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐，加入ph调节剂、碳酸氢钠等药用辅料经冷冻干燥而制成的供肌肉注射或静脉滴注用的无菌冻干粉针。用于病毒性肺炎、病毒性上呼吸道感染等。穿心莲性寒、味苦，能清热解毒，消炎止痛。可用于急性细菌性痢疾、急性胃肠炎、扁桃体炎、咽喉炎等。我国科研工作者于70年代初对穿心莲提取物成分进行了深入研究，结果表明，有效成分为其二萜类内酯化合物。因二萜类内酯化合物均难溶于水，无法满足临床需要，通过在内酯结构中引入不同的亲水基团，增加内酯的水溶性，目前已制成了多种穿心莲内酯针剂，穿琥宁即是抗炎解热作用最强者，目前在临床上已得到广泛应用，1992年被国家中医药管理局批准为全国中医院急诊科（室）首批必备中药之一。

我们通过北京图书馆对近年在医药刊物发表的有关穿琥宁86 篇论文进行分析，在24篇专题报道不良反应的文章中，除1篇只写“使用穿琥宁”外，其余23篇所报道的全部是水针剂。专家认为:穿琥宁水针剂不稳定，在室温条件下有效期为30.5天，因穿琥宁为一个二萜类内酯化合物，而且分子中有一共轭双键，因而化学活性高，易发生水解反应和氧化反应，生产中还要进行高温灭菌，这又促进了分解反应。纯净穿琥宁水溶液微黄略显绿色，但国内市场上穿琥宁水针剂的色泽深，有的甚至变成了黄色或棕黄色。穿琥宁水针剂的毒副反应主要为婴幼儿泄泻，发生率为22%;个别有白细胞锐减、过敏性休克、药疹、抽搐、瘙痒、高热、寒颤、呼吸困难、紫癜等。为了提高穿琥宁冻干粉针剂的质量，本试验研究了“高纯度穿琥宁生产工艺”专利超滤技术，应用于该产品生产并与其它厂家同类产品进行的动物急性毒性试验情况。

1 生产工艺

1.1 仪器88-2型切向流超滤器，cl-25蠕动泵（军事医学科学院）;millipore超滤膜堆（截留分子量:5000）;lgj5型冷冻干燥机;西林瓶洗、烘、灌联动生产线。

1.2 药品与试剂穿琥宁（注射级，成都天台山制药有限公司）;碳酸氢钠（注射级，上海虹光化工厂）;右旋糖酐40（注射级，漯河华颖药业有限公司）;活性炭（针用，上海活性炭厂）;灭菌注射用水（本厂生产）;乙醇（药用，南阳天冠集团酒精厂）;盐酸、氢氧化钠均为分析纯试剂。

1.3 生产工艺（应用超滤技术）（1）在无菌室（百级）配料间内，将穿琥宁（原料药）溶于50%乙醇，加0.5%～1%活性炭（注射级），在25～30℃温度下，用盐酸调ph为6.5～6.7，搅拌30min，吸附原料在生产过程中因暴露空气而带进的热源物质，充分回流，使色泽下降两个色级;用分子截留量5000的超滤膜进行超滤，将5000以上分子量的大分子植物蛋白截留下来;超滤液经重结晶后用无热原注射用水淋洗、滤干，进入配料工序。（2）按千支计算，在无菌室（百级）配料间内，精密称取经计算后处方量的穿琥宁精制品，搅拌加入1.5%碳酸氢钠（注射级）溶液500ml，至溶解澄清;加10%右旋糖酐40（注射级）溶液500ml，加无热原灭菌注射用水至3000ml，混合均匀，调ph至7.7±0.2。取半成品检验，定装量，除菌过滤后，冻干，封口即得。

2 急性毒性试验

根据国家药品监督管理局《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则》中化学药品单次给药的毒性研究（即急性毒性试验）指导原则，对注射用穿琥宁进行了急性毒性试验，观察受试药物一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况。

2.1 试验样品

2.1.1 注射用穿琥宁我公司应用超滤技术试制生产的20020322，规格0.2g，微黄色冻干块状物。临用前以氯化钠注射液稀释至所需浓度。

2.1.2 注射用穿琥宁我公司受黑龙江某制药公司委托加工生产的200101163批，规格0.2g，微黄色冻干块状物。临用前以氯化钠注射液稀释至所需浓度。

2.1.3 注射用穿琥宁我公司在市场上购买的某制药公司生产的020503-1批，规格0.2g，微黄色冻干块状物。临用前以氯化钠注射液稀释至所需浓度。

2.2 试验动物昆明种小鼠，购自河南省实验动物中心，合格证号:医动字第99012号。动物饲料购自河南省实验动物中心，为标准颗粒饲料。

2.3 试验方法与结果（1）试验室温度:（20±1）℃。（2）在预试验的基础上取健康小鼠180只，体重（19.0±2.0）g。雌雄各半，每个批号药物随机分为6组，每组10只。高低剂量的比值设定为1:0.9。根据预

试验的结果，将受试药物配制成不同浓度，20020322批号为45.00、40.50、36.50、32.80、29.50、

26.60mg/ml;200101163批号为45.00、40.50、36.45、32.81、29.52、26.57、23.91mg/ml;020503-1批号为44.55、40.10、36.09、32.48、29.23、26.31g/ml，静脉给药，体积为0.25ml/10g体重，给药速度为5s，给药后即刻观察，记录动物的反应和死亡情况。给药后自高剂量组开始，部分动物出现静伏少动、抽搐、四肢瘫软等现象，并呈抑制状态死亡，动物可随受试药物浓度的不同，出现的反应程度和死亡时间不同。死亡多发生在给药后的30min～48h内，对死亡鼠立即进行尸检，肉眼观察各主要脏器，未见明显异常。对各组存活鼠逐日观察1星期，动物的外观行为、食欲、粪便未见明显异常，试验结束时，存活动物体重分别增长至（25.3±2.7）、（26.1±3.4）、（27.2±3.8）g。实验结果用bliss机率单位计算ld 50 值及可信限，结果见表1、2、3。测得注射用穿琥宁静脉给予小鼠的ld 50 值分别为:批号20020322为910.16mg/kg，其95%可信限为834.84～992.27mg/kg;批号20010163为804.10mg/kg，其95%可信限为748.51～863.82mg/kg;批号020503-1为820.70mg/kg，其95%可信限为758.94～887.49mg/kg。

3 讨论

采用超滤技术生产的注射用穿琥宁ld 50 明显高于其它厂家生产的同规格产品，单次静脉给药的ld

达到910mg/kg，而国家标准说明书中的ld 50为675mg/kg［8］，文献资料报道穿琥宁注射剂的单次静50

脉给药的ld50达到580～620mg/kg［2］，因此，大大降低了注射用穿琥宁产品的毒性，提高了本品在临床上使用的安全性。