欧洲食品添加剂申请指导书

食品添加剂许可申请行政指导

1.介绍

2.申请过程

申请新的食品添加剂许可，原来的在理事会指令89//107/EEC条款已在2010年1月20日由EC条款号为1333/2008代替

申请新的食品添加剂许可需提供一下资料：

-写明申请要求和相关立法依据的申请信

-符合食品科学委员会公布《新的食品添加剂申请指导书》的技术档案

并注意，需要单独提供一份技术档案的总结。

1份信件和2份技术档案综述需要发到一下地址：

（地址省略，布鲁塞尔，比利时）

同时应将完整的申请资料（1份申请信，30份总结文件，3份技术档案）发到欧洲食品安全局的食品添加剂/香料/加工辅导/接触食品材料审查小组秘书处，地址如下：

（地址省略，帕尔马，意大利）

另外，需要将存放在标准物理媒介的电子版全部资料（CD光盘或类似），提交给食品添加剂/香料/加工辅导/接触食品材料审查小组秘书处。电子版资料必须与纸质资料一致。

申请者必须准备多余的纸质和电子资料，以备秘书处需要。因为秘书处可能需要申请者将备份的全部或部分资料发到其他的地址。

申请者必须以挂号信的形式寄送。

关于保密：

申请资料不予保密，并拒绝含有保密信息的申请。认为涉及到保密技术的，申请人须要尽可能的保留。并鼓励申请人将申请资料尽量公开，比如，在网上发布申请资料。

其他信息：

希望申请人在正式递交申请资料前向以上提到的组织机构咨询相关问题和具体细节。

目前只接受英文资料。

以下是申请指导书的具体内容

欧盟委员会

健康和消费者保护总局

C-理事会，科学意见

C2-科学委员会管理部，科学协作和网络

食品科学委员会

SCF/CS/ADD/GEN/26Final

12July2001

食品添加剂申请评估指导

食品科学委员会

（2001年六月11日发布）

引言

目录

食品科学委员会的申请评估过程

文件

介绍

综述性文件

第一部分行政管理资料

第二部分技术数据

1-成分鉴定

2-微生物学特性

3-建议化学和微生物学指标

4-生产过程

5-在食品中的检测方法

6-在食品中的反应和变化

7-建议用量和使用方法

8-人体接触

9-微生物方法获得的食品添加剂

10-转基因生物中提取的食品添加剂

11-现有批准证书和评估

第三部分毒理学数据

1-食品添加剂毒理学评价总述

2-研究方法

3-毒理学档案

3.1-核心研究

3.2-其他研究

4-数据报告

5-研究结果回顾

第四部分参考文献及相关报道

1-参考文献列表

2-文献和报道附录

附录一食品科学委员会的食品添加剂申请流程附录二食品添加剂的主要使用范围

引言

本文件旨在为申请者或其他希望向欧洲市场引入新的食品添加剂，或想修改欧盟现有某种合法的食品添加剂规定，或者申请从新的原材料或新的生产工艺中生产已被承认的食品添加剂的许可。本文件为这些申请资料提供行政性和技术性指导，包括，新的食品添加剂需要提供的毒理学试验材料，向欧盟提交的食品添加剂正式申请材料的格式。申请材料需要提交到欧盟委员会以及食品科学委员会。

在欧盟，只有在充分的科学技术证实及在建议的使用方法下对人体无危害的物质才能被用于食品添加剂，同时证明他们没有误导消费者。欧盟委员在提交食品添加剂相关立法和建议之前必须就人体安全方面先咨询食品科学委员会（SCF）。虽然SCF对食品添加剂的安全性和许可做出评判，但SCF在技术、对消费者的益处及是否会误导消费者方面不作评判。SCF 的工作是给欧盟委员会“就在消费某些食品时产生、消费者健康和食品安全方面提出科学技术方面问题，特别是在整个食品生产过程，营养，农产品技术的应用方面提出毒理学和卫生学方面的问题，以及直接与食品接触的材料的问题，如包装。”

建议申请者按照本指导书及附录上的向欧盟委员会递交申请材料。

并注意，欧盟某些成员国的相关机构可能会需要申请者递交给欧盟委员会申请材料的部分或全部副本，申请者在收到要求之后马上递交材料。

成员国在递交申请食品添加剂市场许可及89/107/EEC条款规定下区域内使用时，充分了解掌握该指导书。成员国应该同时提交完整资料，和手写的添加剂在其国使用安全评估报告。

SCF食品添加剂申请评审过程

SCF申请材料评审过程叙述见附录一

申请档案

介绍

档案格式如下：

档案由委员会保存，也可能对外部其他方开放。因此申请者必须指出档案中哪些部分是商业保密的，同时记住，为了透明原则，只有在非常有必要情况下才会保密。申请者必须保存好申请材料的副本。

档案综述

综述的陈述顺序必须与主要档案格式一致，通常不超过15页。

列出添加剂的种类，来源，生产方法，建议使用方法等，同时总结毒理学测试方面主要结论和发现。并需要申请人展示其自己得出可能的添加剂使用安全方面的结论，提出需注意的异常数据。

第一部分行政管理资料

1.申请人名称（公司，组织机构等），地址及其他联系方式，比如电话，传真，E-mail.

2.生产商名称（如与上不同）地址及其他联系方式，比如电话，传真，E-mail.

3.档案主要负责人姓名，联系方式，如电话、传真、Email.

4.递交申请档案的日期

5.档案的目录

第二部分技术资料

1.物质鉴定

1.1化学单体（如山梨酸，抗坏血酸，没食子酸丙酯，甘油等）

-以IUPAC命名法为依据的化学名

-CAS号（若以被归类）

-同义词，商业名称、缩写

-分子式和结构式

-分子量

-光谱学数据（若能鉴定该物质）

-以百分比计的纯度，定量方法，数据输出（色谱图，光谱图等）

-杂质：性质，百分比，检测方法

-物理状态描述

-溶解性

-其他申请人认为有助于该物质鉴定的数据资料

1.2.简单混合物（如，山梨糖醇液，软磷脂等）

-化学名（若有）

-CAS号（若有）

-同义词，商业名称、缩写

-混合物组成成分，每种成分所占比例

-混合物各成分的分子式和结构式

-混合物中各成分的分子量

-用于鉴定混合物的光谱学数据，如IR，UV，NMR，MS等

-纯度以百分比计；定量方法；数据输出（色谱图，光谱图等）

-杂质：性质，百分比和定量方法

-物理状态描述

-溶解度

-其他申请人认为有助于该物质鉴定的数据资料

1.3.复杂混合物（如蜡，矿物油，花青素，焦糖，叶黄素等）

-原材料

-化学名称（若有）

-CAS号（若有）

-同义词，商业名称、缩写

-化学描述和组成成分（若能检测）

-物理状态描述

-纯度级别，纯度鉴定主要原理

-杂质：性质，百分比，定量方法

-溶解性

-其他申请人认为有助于该物质鉴定的数据资料（如光谱图，色谱图等）

1.4.（生物）聚合物（如琼脂，藻朊酸盐，黄原胶，果胶，淀粉，修饰淀粉，纤维素，聚乙

烯吡咯烷酮等）

-化学名称（若有）

-CAS号（若有）

-同义词，商业名称、缩写

-化学性质描述

-化学式和已知分子量范围

-取代度，取代基的百分比（适当的）

-物理描述

-溶解性

-鉴定方法描述

-含量：百分比和计算模型

-纯度级别（若有）

-杂质：性质，百分比，定量方法

-其他申请人认为有助于该物质鉴定的数据资料

2.微生物学性质

2.1若最终产品中有存在活的或死亡微生物，应该就其可能致病性和产毒素性及他们在内脏中的影响进行描述。

3.建议的化学或微生物学指标

3.1建议指标应该以最近的欧盟或国际上接受的指标提交。若建议指标与现有的JECFA（世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会）或其他国际上被认可的指标不同，这些应该与建议指标一同列出，并指出它们不同之处。

4.生产流程

应该包含以下信息：

4.1生产方法（如原料，将原料加工成最终产品的方法），生产控制和质量控制。

4.2对于合成物质，列出反应顺序，副反应，纯化，商业产品的制备，这些有助于确定可能的杂质和他们对毒理学评估的影响。

4.3对于从自然资源中提取的物质，提供提取过程。

5.在食品中的检测方法

应该提供以下方面的信息：

5.1该物质及其分解产物在所添加的食品中的分析方法。分析方法应该全面完整，若分析方法已经被很好建立并广泛使用，可以只附在参考资料中。

6.在食品中的反应及转化

应该提供以下方面的信息：

6.1在食品加工，储存，制备过程中，该物质的稳定存在，出现的降解产物或反应产物6.2对营养物质产生的影响

7.建议使用需要和使用方法

应该提供以下方面的信息：

7.1使用方法，使用目的，对消费者的益处

7.2具体食品的添加量（应该添加的量，最大添加量），在食品中的残留

7.3在建议添加量下的该物质使用效果调查

详见见附录二

8.人体接触

8.1应该提供已知或预期的人体与食物中添加剂可接触的量（如最大或平均食用量或接触量），接触频率及其他影响接触的因子。也应该提供人体与该物质接触的其他可能方式（如饮用水，消费的其他产品等）

8.2应为以上数据提供解释，包括任何假设。若有可能，提供加入该添加剂后食品的消费情况，包括对不同人人群的影响（如年龄，性别，疾病情况等）

9.微生物方法获得的食品添加剂（无关，略）

10.转基因生物中提取的食品添加剂（无关，略）

11.现有批准证书和评估

11.1提供现有的任何国家批准证书或者其他组织机构的评估

第三部分毒理学数据

1.食品添加剂毒理学评估总框架

若食品添加剂的技术需要和对消费者的价值已经建立，那就有必要评估该添加剂对消费者健康的影响。SCF在1980年发布第一版食品添加剂安全评估指导书，其中很多原则至今仍在使用。然而，从那时起，很多其他食品添加剂的安全评估原则相继发布，其中包括JECAF （由FAO/WHO共同专家委员会）发布的，并且在这些不同的版本原则有很多相同点。因此现在不是为了重复这些原理，而是列出SCF要求的食品添加剂安全核心检测的框架。SCF 的这份指导和其附录是取代SCF1980年发布的添加剂必要毒理学检测项目。

毒理学检测的目的是确定，在建议的用量和用法下，添加剂是否会对消费者造成一定的危害。检测不仅要提供一般人群的信息，对那些具有特定的饮食结构，或生理健康状况使他们容易受到危害的人群，如年幼，妊娠期，节食者等。虽然没有固定的检测项目，但有涉及到核心检测和其他检测项目的固定框架，这样可以让申请人知道需要提供哪些信息来建立添加剂食品安全体系。对于不管是新的食品添加剂还是重新审核的现有添加剂，要依据不同添加剂的性质、建议使用方法和使用量，来提供研究资料。除了实验室检测试外，还可能需要提供由医学应用、职业流行病学或在志愿者做的具体研究（如吸收和代谢方面的资料），或大量接触的实验等人体试验数据。但是，对一种新的添加剂而言，安全评估通常是集中在实验室动物实验的数据。如果该物质的生物作用已经定性定量地在一定范围的动物实验中确定，那么在它在人体内的作用可以通过严谨的推断得出。

总之，本指导书主要是用于新提取的食品添加剂的评估，或者已有食品添加剂的重新评估，直接加入到食品体系中并完成一个清晰的定义。不适用于风味剂，或者从包装材料中迁移到食品中的物质，也不适用新型的食品，况且SCF已经就新型食品单独发布了指导书。它还不适用于其他不管是自然发生还是认为造成的的食品污染物。但是这里很多的食品添加剂安全评估试验同样可以用在其他食品化学成分的毒理学评估。

2.研究方法

食品添加剂的毒性，动力学及代谢的研究方法应该使用国际上承认的方法。建议采用OECD （经济合作与发展组织）发布的，或者欧盟指令中的方法。同时建议使用任何指导的最新版。若使用仿佛与国际承认的不同的，应该提出正当理由。对于与标准方法不同的特殊研究，应以以实际情况进行改良。

为保证成员国对提交数据的互相承认，研究必须在理事会指令87/18/ECC描述的良好实验

室操作（GLP）原则进行，并提供符合GLP的声明。GLP要求的执行范围已在1988年理事会指令88/320/EEC扩展到食品添加剂。若与以上原则有分歧，需要提供充分的解释。若研究工作发生在GLP公布之前，是可以予以考虑的，特别是当这些研究与一些旧的物质或已被欧盟允许的食品添加剂有关。

申请人必须注意理事会指令86//609/EEC，为了保护用于试验或其他科学研究的动物，要求注意避免不必要的动物使用。只有在像添加剂的安全性时使用，同时试验设计要符合减少，提纯和替代的原则。然而，加入没有足够的人体数据，用了相近物种动物做的活体试验，也要评价人体摄取食品添加剂后可能产生的危险。但有例外实验（如的潜在遗传毒性评估的活体研究等）或者用其他可替代的确凿方法来确定毒性，能减少或不适使用动物。对于用替代方法的，根据实际情况进行考量。

3.档案的毒理学部分

通常，对于任何提出的添加剂，在被认定可以安全使用之前，都需要经过广泛的就潜在毒性反应的检测。申请人应该提交以下核心试验的研究，同时可以提交其他认为有用的试验。在有些情况下，可以考虑不必采用一整套的核心检测（如该物质是通常人体饮食组成成分，或是人体的组成成分，或者在代谢中产物，也或者是已经有其同系物或类似活性结构物质的毒理学数据，摄入考虑）。或者，若完成了一定的研究，可以考虑不用再进一步测试并根据现有结果确定安全性。也鼓励用其他的测试而不是现在的常规测试。

采用非常规测试和不采用一些测试，都需要声明原因。得到的所有重要结果，不管是有利的还是无利的，都要提交上来，以便进行独立地严格的评审。申请人还应提交现有的其他相关数据，包括已被报道的文章的副本。

3.1核心研究

食品添加剂评价通常需要核心研究如下。关于核心毒理学的具体要求已经列在附录中。a）代谢/毒代动力学

新的添加剂的代谢和毒代动力学的相关资料应该都被列出来。根据被测物质的不同可以设计不同的研究方法。不用将每个方面都考虑进去，可依据实际情况而定。原则上，要使用单次的或重复的动物实验。体外实验也可提供有用的信息。

b）亚慢毒性

新的添加剂通常要进行亚慢毒性的研究，通过饮食，2个试验物种，啮齿类和非啮齿类，至少90天的试验较好。进行14至28天的喂食试验可以为目标器官和90天试验提供依据。但是少于90天的研究通常是不足够用于评价亚慢毒性。

c）基因毒性

新的添加剂通常需要经过基因毒性方面的测试，以确定其没有潜在的致突变性和致癌性。通常需要进行一组有3个试验构成的基因毒性试验，包括：

i细菌基因突变试验介绍

ii哺乳动物细胞基因突变试验（体外内）的介绍

iii哺乳动物细胞染色体畸变（体外内）试验介绍（一般小鼠淋巴瘤细胞）

以上试验若得到阳性结果，通常要在体外内进行进一步的基因对性评估。

d)慢性毒性和致癌性

新的食品添加剂通常要进行慢性毒性和致癌性的研究，2个物种喂食试验，试验周期一般跨度试验动物的整个生命周期，通常是大鼠24个月，小鼠18或者24个月。慢性毒性和致癌性性研究可以结合进行。

e)生殖和发育毒性

新的食品添加剂通常需要进行繁殖和发育毒性研究。多代繁殖试验，包括与潜在激素干扰有

关的研究，一般在至少两代大鼠，每代大鼠一仔上进行。被测物的加入一般通过喂食进行。发育毒性的研究一般在2个物种上进行，通常是啮齿类和非啮齿类，如大鼠，小鼠或兔。通过喂食或者填喂法摄取，试验不仅要在胚胎生成期进行，还要持续到妊娠期的结束，以便保证检测到潜在的激素干扰。

为了保证接新的食品添加剂不会对产后功能和发育造成影响，包括神经功能，行为的、身体的、功能性的、行为性的发育造成影响，试验必须在胚胎形成初期到断奶期持续进行。这样的实验可以单独列出，或者作为多代和发育毒性研究的一部分。

3.2其他研究

除了以上核心研究，对于一些特定的物质可能还需要其他的必要的研究，如化学结构、分类、应用、已知或预期的毒性等方面的研究。至于是否需要其他研究根据具体情况而定。其他研究包括但不限于：免疫毒性、变应原性、耐受反应、神经毒性、志愿者人体测试、预期代谢研究，和其他就核心试验的一些发现进行进一步的研究。

进一步对其他研究的相关性、角度和应用及上面提到的研究的讨论见这份指导书的附录。另外一些食品添加剂安全研究，如工人安全（急性中毒、辐射、过敏性等）等为其他目的进行的研究，不作要求。但若做了这样的研究，希望能提供，因为它们可能提供了很好的背景知识。

4.数据报告

标准毒性研究的数据报告应当尽可能根据相关的OECD指导中的数据报告进行。申请人必须注意，申明在试验中用到的材料是否符合建议的或者现有的规格。若不符合，应该给出实际的规格，并指出该规格是否与市场上具有代表性。

5.试验结果和结论回顾

对于每项研究都要指出主要的发现，若已经找出无明显有害剂量或者相关信息，则要写明。如果只有在高剂量/高浓度时才出现反应，那么接触量增加毒性反应和人体将该物质作为食品添加剂的使用量的关系，必须进行讨论。

在这部分还要解释数据并得出结论。并仔细解释忽略某些发现的原因。若有必要，结论还应解释作用机制方面的重大发现，并讨论它们是否与人体有关，若有关，还应对此进行推断。列出已知人体接触作用（或无作用）；比如提供有记录的职业性或临床性接触的证据将很有帮助。对潜在危害人体的总的评价应该列在，叙述已知或可能人体接触的文章部分，文章可以来自其他地方。

第五部分参考文献和报道（暂时省略）

1.参考文献列表

参考文献应带按一下方式列出：

1.出版时间

一到原文的17页，接下来的部分由以下部分组成

二申请过程（18页）

三食品添加剂的分类和解释（19-20页）

四指导书附属部分毒理学（21-42页）

目录

一介绍扫

二核心毒理学研究

a)代谢和毒代动力学

b)亚慢毒性

c)遗传毒性

d)慢性毒性和致癌性

e)生殖和发育毒性

三其他研究

a）免疫毒性

b）过敏性

c）食物耐受性

d）神经毒性

e）志愿者试验

f）体外实验代替活体试验

g）特殊研究

h）急性毒性

i）皮肤和眼睛刺激性和皮肤敏感新

参考文献

一介绍

附属部分主要就“食品添加剂的指导书”毒理学方面进行进一步说明。建议申请者同时参考指导书内容和这份附属部分的内容。

二核心试验

a）代谢和毒代动力学

代谢和毒代动力学应提供被测物的吸收、身体分布、新陈代谢、排出（ADME）方面的数据。对评价添加剂安全性时，要将ADME所描述的特征数据纳入考虑。因为他们在以下方面有非常有用：1.确定毒理试验的范围（对于不吸收物质，或者代谢产物为一般的饮食成分和人体的组成成分，可以减少测试）2.选择合适的试验物种，剂量，及合适的毒理试验周期 3.对其他毒理学数据的解释和评估 4.了解毒性的代谢机制

代谢和毒代动力学研究的设计必须可根据被测物的不同而被调节。不是所有的被测物都要经过各个方面的调查。原则上，需要单次或重复的动物实验。这样有助于确定胃肠的吸收情况，整体的消除速率，重复试验是该物质的催化反应动力学上发生的任何变化。同时，动物实验也有助于提供毒性的其他方面的信息，如胎盘的转移、代谢中酶系统的诱导与抑制、可逆和不可逆性地与组织位点及载体蛋白的结合。并应注意，在体外试验研究中，运用酶、亚细胞结构、细胞培养、器官灌注等，同样可以为代谢途径、毒性机制、对酶的效应以及其他具体问题，提供重要的资料。

对于复杂的混合物，传统的代谢和毒代动力学可能不可行。那应该寻找其他的方法来研究生物利用度，以及可能的话，研究组织分布和富集。

人体上毒物动力学信息对以下有相当大的价值，包括动物模型的确定。若有其他关于该物质及类似的化学物质资料也要提供。若有可能，并鼓励申请人将开发相关信息（见III人体志愿者研究）

b）亚慢性毒性

亚慢性毒性研究的主要目的，是通过对试验动物的重复试验来量建立被测物的毒理学轮廓。这样的试验可以提供目标器官、添加剂对人体影响的严重性、影响的性质以及剂量和反应的关系等方面提供很多信息。这些试验同时应该能确定最大无作用剂量，而高于这个剂量就出

现了不良反应。比如无作用水平。它们同时对估计急性试验的适合剂量有很大的价值，同时为进行就某些作用另外的研究，如神经毒性、免疫方面等提供依据。

新的食品添加剂通常要在2个物种上进行口服毒性研究，一般为啮齿类和非啮齿类，持续时间至少为90天。进行14至28天的喂食试验可以为目标器官和90天试验提供依据。但是少于90天的研究通常是不足够用于评价亚慢毒性。若用可能，应该采用哪些代谢机制和催化动力学参数与人类相似的物种（见上面a项）

根据相关的OECD知道（1，2），研究应该包括食品消耗量、体重的计量、血液的检测，血浆、血清临床生化检测及尿液分析。对于啮齿类动物，尿液分析不是必须进行的，但是当怀疑对尿液参数有影响的时候，应该进行尿液分析。除了仔细的肉眼尸检和各器官体重的称量外，还有必要进行整套的组织病理学检测。

c）基因毒性

新的添加剂通常需要经过基因毒性方面的测试，以确定其没有潜在的致突变性和致癌性。基因毒性的测试主要目的包括精子细胞突变的检测，因为它们可能成为人类可遗传性基因缺陷的病因，也包括体细胞突变的检测，因为它们可能致使转变为肿瘤或其他疾病。目前公认的有3个水平的突变，有单个基因水平、染色体水平、基因组水平（大量的染色体改变导致异倍性）的突变，而这些对可遗传混乱和癌症有相当的影响。特别是癌症，人类肿瘤的大量实验数据证明，某个位点的突变或迁移将激活致癌基因，或/并且，基因的杂合性的散失或其他突变的事件将使抑癌基因失活。

基本试验

目前没有一个单独的测试方法能为以上提到所有遗传终点提供信息。所以有必要为每一种物质提供多个检测以获得全面的潜在遗传毒性的信息。对于人体大量接触的物质（如食品添加剂、农药、药物等），建议采用由3至4个基因和遗传水平的试验组成的测试方案，有时候也包括活体试验。

总之，尽管SCF要求食品添加剂的遗传毒性的试验是一组有3个体外试验组成的，但若出现阳性结果一般要求进一步的活体试验再次确定。要求的试验有：

1细菌基因突变试验介绍

2.哺乳动物细胞基因突变试验（体外内）的介绍

3.哺乳动物细胞染色体畸变（体外内）试验介绍（一般小鼠淋巴瘤细胞）

至于试验方法，建议采用OECD操作步骤。OECD最近更新的6个，引入了1个新的

相关指导。更新的指导包括细菌基因突变体试验、哺乳动物细胞突变试验，哺乳动物细胞染色体畸变试验，以及染色体畸变活体试验、啮齿类动物骨髓微核活体试验和精原细胞染色体畸变活体试验。新的指导涉及到活体和体外的大鼠肝脏UDS检测分析。欧盟已经建议将这些检测方法定位官方的检测方法。

既然涉及到哺乳动物基因突变试验，建议采用对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y的tk位点进行检测的试验系统。与半合子位点（HPRT体系）的基因突变系统相比，销售淋巴瘤细胞的检测覆盖更广的基因事件，甚至包括了杂合性的消失。因此这个系统能非常敏感地找出潜伏的遗传毒性。

以上是食品添加剂的核心试验，但是在某些情况下，在提出充足的理由后，可以不必进行所有的试验。此时，必须提出充足的科学依据。若某些物质由于本身的理化性质说明其不具有活性，那么以上的部分或全部核心试验可以不用进行。

另外，有些情况下需要增补一些体外和活体分析，特别是体外代谢和毒代动力学数据不够明显时（如，一些代谢途径存在于肝外，或者肝S9中的细胞色素同工酶很少）

异倍性

同时要考虑到当染色体分离受到干扰时，将会出现染色体异倍性。最新的OECD染色体中期分析要求对多倍体的计数和记录，这样在试验结束时提供一些线索。另外骨髓微核试验和其他可以通过检测着丝粒和动粒而检测到染色体因不同机制消失的试验，可以为非整倍体的形成提供信息。因此，微核试验应该作为活体细胞效应的一种评价方式。

活体试验

在体外试验取得阳性结果后，活体遗传毒性试验将发挥重要作用。在一般情况下，体细胞和生殖细胞体外试验出现阳性结果后，要调查在体细胞活体试验中是否会出现基因毒性。但在生殖细胞活体试验需要以实际情况进行考虑。大致上，骨髓细胞遗传学肝脏UDS分析为阴性，可以说明该化学物质对生殖细胞的致突变性很低或者没有致突变性。另外，单凭骨髓细胞和肝脏细胞活体试验阴性不能排除会发生一些局部的遗传毒性反应（如胃肠道表面），特别是那些直接反应的亲电子分子。在这种情况下，专家应该根据现存的化学反应活性、胃肠道吸收、排出、排泄物及代谢机制等信息，作出判断。并最好做一些像DNA共价键形成的试验。

未来的发展

委员会清楚鉴于目前的发展情况，未来可能要在遗传毒性试验方面做些改变。比如，正现在评估将体外微核测试方法整合到OECD指导中的遗传毒理学测试。不久后可能考虑将其作为体外染色体畸变分析的替代方法，并成为测试组合的一部分。它是检测到导致染色体消失或染色体断裂的纺锤体混乱的有效工具。然而目前，应该将细胞分裂中期分析的标准体外试验方法用于评估细胞损伤。

像彗星试验、转基因动物的特定位点突变等其他方法，可以为食品添加剂潜在的基因毒性和致癌性提供有用的信息。但是，有些方法还为经过批准，所以目前，对于用它们进行危险鉴定还应谨慎。

现在可以确定的是，目前很多有益的方法可以用于检测潜在基因毒性，这个领域也正在发展。可以设想，随着科学水平和技术进步，对这些指导进行周期性修订是需要的。

d）慢性毒性和致癌性

慢性毒性

慢性毒性研究的主要目的是通过对试验动物长期喂食或其他合适的途径，为总的及组织病理学上的改变提供资料，而不是为器官及组织的肿瘤形成、血液、血清、尿液的化学参数变化等方面提供信息。通过这些研究可能会发现亚曼毒性方面新的但不是证据性效应，他们可能在同剂量或较低剂量下进一步确定的亚曼毒性测试的结果。慢性毒性研究通常对确定添加剂的无明显有害效应剂量水平和容许日摄入量起核心作用。

慢性毒性研究是根据OECD试验方法独立进行的。但是也可以在同一个试验中，结合慢性毒性研究和致癌性研究方法来检测食品添加剂。慢性毒性研究最常用的试验动物是啮齿类动物。在少数情况下，可以在其他类物种上进行长期毒性研究，比如狗或其他非人灵长类动物，此时若观察到毒性反应，那根据毒代动力学或者方法的要求，就有必要使用这些物种。

显微镜检查应该用到身体所有的器官和组织检查中。但是也可以只对对照组合最高剂量组，检查其在显微镜下的不同。应当保留较低剂量组的组织切片，以备以后进一步检测需要。在亚组试验动物3、6、12个月的时候及研究结束时，对临床化学、尿液分析、血液分析上检测，但在试验动物生命末期，试验数据变化较大，对此进行分析则较为困难。若卫星组动物以一定的时间间隔被处死的时候没有收集到样品，要确保没有了这些样品，剩下继续试验的样品不会因此而受到牵连。

致癌性

提出的食品添加剂通常要在试验动物上致癌性评估。致癌性研究的主要目的，是试验动物给予适当的喂食，观察在其大部分的生命周期里接触了添加剂后，是否产生了肿瘤损害。

参与致癌性试验的动物应该在生物上有助于评估人体危害。但是，基于可操作性的考虑，试验物种的选择有限，通常只有试验大鼠和实验小鼠。OECD致癌性试验操作方法近年来没有进行很大的修改。由于食品添加剂要求进行慢性毒性致癌性检测，建议将两者结合在一个试验中，以便在最少的试验动物中得到最多的信息量。除了对特别意见的考虑，一般不要求子宫接触试验。在确定最高剂量时，要仔细参考OECD上的意见，剂量尽量高的同时不会对试验动物寿命造成因肿瘤原因引起的很大影响。比如，最大耐受剂量（MTD）一般不会使试验动物体重下降超过10%。超过MTD的剂量不利就对人类的致癌性做出推断。相对而言，食品添加剂是无毒化学物质，去确定MTD是无意义的。若食品添加剂通过饮食摄入，为了不影响营养均衡，剂量通常不超过饮食的5%，即便是没有毒性反应，超过这个水平的剂量是不可取的。

若出现了致癌性反应，致癌机制方面的资料和毒代动力学方面的数据通常对危害评估，对人体影响的推断，非基因毒性致癌物的判定，都起着核心作用。这考虑通常出现在进行长期试验时得到的过渡性的结论，以便修改试验方案或安排另外的试验以得到机制和毒代动力学方面的信息。

致癌性试验的未来发展

科学界一直对一些问题有些争论，即是否有必要进行2个啮齿类物种试验，是否必要性大鼠长期活体试验时还另外补充短期或中期的啮齿类活体试验，这里的啮齿类动物模型是指形成和发展模型或初生小鼠或转基因小鼠致癌模型可以用于寿命的生物检测替代方式；或者，代表两种性别的生物检测的雄性大鼠和雌性小鼠模型来代替原来要求的两个物种模型；在单个物种上，跨度整个试验动物生命周期的长期试验，加上短期的遗传毒性试验，及机制方面的是否足够能够足以证明。由于与非遗传毒性致癌物相比，生物测定经常被发现在不同物种、不同性别的试验动物被发现有较高的致肿瘤率，因此缩减的生物测定方法足以用于检测遗传毒性致癌物。然而，为了优化检测到非遗传毒性致癌物的可能，试验在最好再多余一个物种上进行。除非国际上统一了一种新的评估致癌风险的方法，或由于其他特点的考虑，食品添

加剂试验一般都要在两种性别的大鼠和小鼠上进行。

e）生殖和发育毒性

生殖

生殖试验的主要是为以下方面的影响提供信息，雄性和雌性的性欲；性交能力和生育力；雌性的怀孕能力和时间；母体哺乳和对幼仔的照顾能力；产前和产后存货率；子代的生长发育；后代的繁殖能力及鉴定是否对母代和子代的目的器官（包括生殖器官）的组织结构照成影响。子代的功能和行为方面的发育也被认为相关，下面就这些方面进行进一步讨论。

由于大部分的食品添加剂人体会终生都接触到，食品添加剂的生殖试验通常要跨几代，并包含激素紊乱的评估。试验应该在一个试验物种上进行，通常是大鼠，并且试验要求试验动物至少是2代、每代至少一胎幼仔。在某些情况下（如对照组的繁育率低，或者处理的影响不明显），需要对再对一胎进行试验。被测物质一般通过饮食持续地喂食母代和子代。

对于雄性繁育能力的调查虽然不是常规性的，但某些情况下要进行，这取决于物质的化学结构及多代繁殖的试验结果和其他的研究情况。

产前发育毒性

产前发育毒性试验（曾被称为致畸性试验）的主要任务是，通过对胚胎或胎儿的重吸收或者是死亡的检测、胎儿体重、性别比率、外部形态、内脏形态、和骨骼形态的检查，来鉴定是否有潜在的对胎儿或胚胎的致死性、致畸性和毒性作用。试验通常在2个物种中进行，啮齿类和非啮齿类，比如小鼠、大鼠和兔。在一定的情况下，也可以食用其他的物种。试验不仅要在胚胎形成时进行，还要持续到距预产期前一两天，通过将妊娠期前母体处死观察胚胎情况。剂量时期的延长是为了确保能检测到像激素紊乱特点。被测物加入到食物中，或者通过填喂法使试验动物摄入。对啮齿类试验动物而言，发育毒性研究可以作为多代研究的卫星研究进行。

产后发育毒性研究

试验动物的幼仔与化学物质的接触有在产前通过母体接触和产后通过母乳接触到，这可能对产后幼仔的发育和功能造成影响，这包括神经功能和行为方面的功能。试验动物对化学物质的接触从胚胎形成开始至少持续到断奶时，并对其的身体的发育、功能上的和行为上的发展的进行研究。尽管以这样的方式对药物进行试验有着丰富的经验，但是没有提出一个规范的操作方法。合适的策略应该包括对产后早期和成年期的试验动物进行发育上的、功能上的和行为上的广泛观察。相关的观察可能是像幼仔体重的测量、及断奶前生理上或功能上发育的标志的观察，这包括反射的发展、通过测量阴道扩张来记录性成熟的开始、雄性动物龟头包皮腺的裂开、感知和移动功能和一些认知功能迹象（学习和记忆）（见第三部分d神经毒性）

食品添加剂的婴儿配方：特殊情况

标准的毒性试验方法不足以为初生婴儿人工喂养提供模型参考。婴儿也要花一些时间才能建

立解毒机制。因此SCF建立发展了一些特殊的策略，其中包括规范婴儿食品添加剂的ADI 值（1998年9月17日发布），婴儿营养配方中的添加剂，接下来的配方和断奶食品（1996年7月6日发布）。

对于被建议用于婴儿配方的食品添加剂，而由于其结构的原因而不能凭已有的数据进行评价，那么就可能需要采取特殊的策略。试验动物的剂量体系应该足够为人类在剂量、母体化合物接触、不同物种在神经发育时间上的差异和其他发育参数提供模型。若只是通过母体接触而间接接触，或者通过代谢机制通过母乳接触，那么就不用进行特别的试验。但若被测物从出生到断奶这段时间直接通过口服与子代接触，那么就需要进行必要的研究。要对产后的子代存活率、生长、发育、行为进行必要的检测。在有些情况，可以认为在其他物种上的研究是足以为人类的情况提供模型。

第三部分其他研究

以下就对建立添加剂安全较有用或相关的其他研究及大致研究方法进行了讨论。但这些不应该被认为是需要进行的全部试验清单。

对于头3项涵盖免疫毒性、过敏反应和食品耐受不良的研究，需要理解以下概念：

免疫毒性：指化学物质可能会削弱免疫系统对外来物质和病原体的反应效率。

过敏反应：指接触蛋白质或蛋白-半抗原结合物后出现的免疫病理反应。

食物耐受不良：对某种食物出现不良反应，该反应现象类似于食物过敏，但不是过敏反应或者不是直接通过免疫系统调节产生，而是涉及到其他几个机制。

a）免疫毒性

介绍

免疫毒性试验的主要目的是检测和评估化学物质对免疫系统造成的不良影响，以及免疫系统对外来物质或病原体的反应效率的影响。具有免疫毒性的特点的物质一般对对大部分的人的免疫系统都有毒性。当化学物质侵害免疫系统时，就会出现毒性反应，导致免疫系统功能的改变。化学物质攻击免疫系统时，产生的毒性会增加传染病的发生和导致一些肿瘤疾病。同时也会导致加重有某种基因倾向的个体的过敏反应和自身免疫病。

机体的非特异性防御机制能防御一些病原体的侵入，比如溶解酶、干扰素、求补系统及巨噬细胞和白血球对小微粒的吞噬作用。同时机体还具有特异性免疫机制。免疫反应时复杂的过程，它是免疫系统的细胞和抗原的相互作用，形成对传染性物质、外来移植组织和一些肿瘤细胞的抵抗机制。免疫的基本特点是记忆系统的建立：与抗原（如具有传染性的组织）的第一次发生接触时，它记录了特定的信息。当相同的抗原第二次接触时，就会发生比第一次更快速、更显著的反应，即为第二次免疫反应。特异性防御机制和非特异性防御机制的相互协作发挥作用。虽然免疫系统的两种手段是相互独立，但还是存在很多一些相互关系。第一种是细胞免疫反应，包括有特意敏感性的T-细胞执行的反应及由这些细胞转移。这些反应的主要有经典的细胞介导免疫反应（抵御真菌、病毒、细菌），延迟的过敏反应，对肿瘤和外源移植组织。另外一种由体液免疫组成，是有产生抗体的浆细胞B淋巴细胞执行。这个免

疫方法可以通过血浆和包括抗体介导的免疫保护反应、速发型过敏反应、细胞毒素和综合的反应进行传递。对常规免疫反应不同整合起来进行评估构成了对化学物质潜在免疫毒性评价的基础。

免疫毒性试验

有很多方法能对对大部分动物的免疫功能进行评估。但有些试验在检测和评估食物中化学物质直接免疫毒性的有效性却有限，或者它们的确凿性还未建立。最好用一组方法来从大量分析方法中选出合适的。

与其他方法相比，通常要求用大鼠90天重复剂量毒性试验来评价食品添加剂安全性。在这试验中已经包括了对免疫系统的评估。与OEDC指导408相符的研究包括白细胞分化循环的评估和淋巴器官的重量及组织病理学，如胸腺、脾脏、肠系膜淋巴节、腘淋巴结核回肠。骨髓细胞也要进行调查。这种评估通常称为逐级自身免疫毒性测试(可能翻译有误）。如果逐级自我筛选发现的免疫毒性反应，不是在该化学物质其他毒性和营养方面的影响和与其他毒性反应有关的剂量下产生，那么就应该进行二级研究。二级研究包括各样的活体和体外研究，主要是评估细胞介导免疫和抗体介导免疫（体液免疫）、巨噬细胞功能、自然杀手细胞和在实验性感染模型中寄主的抵抗能力。寄主抵抗模型能评价免疫系统的几个方面。除了functional endpoints，感染模型也可能包括组织损伤的评价。这样免疫功能评价系统可能对确定无明显有害效应剂量水平和危险评估都非常有用。

由于目前的核心试验鉴定出所有的潜在的免疫毒性物质，正在对OECD指导中的重复剂量毒性试验进行讨论，如再添加些简单的免疫功能试验。其中一个这样的研究就是在对羊红细胞敏化作用后测量特定抗体效价。抗体效价是产生于红细胞的降解、红细胞抗原对T细胞的呈现、T细胞依赖的B细胞的成熟和浆细胞的抗体产生。总之，免疫系统所有主要的成分都影响到抗体效价的最终结果，所以这个分析方法足以用来探究免疫系统受到的潜在干扰。

b）变应原性

过敏性是当机体接触蛋白质或半抗原-蛋白结合物是出现的免疫病理反应。只有具有基因倾向（遗传过敏症）的特定个体才会出现这样的反应。大部分对食品添加剂出现的不良反应不是以免疫原理为基础（见下面第三部分，食物耐受）。然而，像有些含蛋白或多肽的食品添加剂可能也会促使产生过敏反应。目前为止还没确凿的模型，能说明食品成分（包括添加剂）在某些易感人群中通过食用接触而引发潜在过敏反应的。正在研究的某些动物模型或许最终能说明，但是就总体的测试而言，还没看到这样的反应。现在可能只有通过进入市场后的监测来发现这样的反应。

有很多方法调查通过皮肤接触和吸入产生的敏化作用，但主要是用于职业性危害的评估，它们与口服后过敏反应的关系还不清楚。工人在食品添加剂合成或生产的时候产生过敏反应可以成为一个警示信息。也可以根据化学结构和、已知过敏原的关系和对蛋白水解作用抵抗等信息来评估潜在过敏性。

c）食物耐受不良

食物耐受不良是对食物产生与事物过敏相同的症状，但是事物耐受不良与免疫系统没有直接的关系，它涉及到几个机制包括，酶缺陷、食物成分本身的药理学活性、与噬碱性细胞和肥大细胞作用后释放的内在介质。它依据物质或个体差异，可能表现为如哮喘、湿疹、荨麻疹和胃肠道反应等症状。对有些机制有很好的了解，但由于反应的差异性和易感人群的不同（包括遗传性易感、神经系统的反应能力等），现在还没有一个简单的动物模型来鉴定出物质耐受不良性。对易感人群调查的方法在SCF报告中已有讨论。

d）神经毒性

成人的神经毒性

90天喂食试验等核心试验，及其他像结果筛选、结构和活性关系或者理化性质等信息指出被测物质具有神经毒性，那么就需要用逐级方法进一步调查。试验策略不能死板，要根据实际情况决定。但还是存在一些总的原则。指示具有潜在毒性的初步试验研究成为一级测试。建议参考以下策略来进一步检测神经毒性。

二级测试，如OECD指导中的“啮齿类神经毒性研究”是广泛的、有探究性的试验，但只被设计用于评估神经系统，其主要目的是支持或排除神经毒性的怀疑，不是鉴定物质的具体本质。之前的研究信息可提高剂量的设计。通常为了避免与一般毒性测试结果混淆，二级测试比一级测试的剂量要小。

三级测试由对具体有充分证据证明神经毒性的神经毒或物质进行特定研究组成。主要目的是通过阐述机制从动物推断到人体，并进一步说明危害特点和完成危害评估。

二级和三级研究主要关注试验动物的肌动活动和功能、感光知觉和认知功能。根据目前的方法，还不能从动物中观察到像人类具有的情感和性格方面出现影响的提示。由于对神经系统的结构性和化学性评价要通过行为的观察实现，因此对行为上影响的评估要与合适的神经病理学、神经生理机制和神经化学上的评估一起考虑。已有确凿的方法对一些主要类别的行为进行评估。在OECD草案：“神经毒性指导文件，2000”可以找到有价值的指导方法和试验策略。

发育神经毒性

化学物质对在器官形成时期及随后的婴儿期脑部发育的影响也要考虑。激发这些研究的原因包括在进行核心毒性试验时观察到脑部在形态上、功能上和行为上发生畸变，观察到成体出现神经毒性反应，或者基于结构和活性关系考虑，该物质是潜在神经毒。一份发育神经毒性OECD指导正在准备中。

e）人体志愿者研究

介绍

在食品添加剂进入市场之前或之后，人体试验都能提供非常有用的信息。同样地，在某些情况下，从对人体治疗机构的安全调查获得的经验可以用于食品添加剂的人体研究。

人体志愿者研究的适用

人体试验不应该被用于建立食品添加剂一般安全体系。只有在从动物研究或其他相关研究中获得足够的证据证明，在建议的接触剂量下是对人体是相对安全的时候才能建议适用食品添加剂人体试验。提出的任何研究都应该有明确的科学目的和详细的操作步骤，包括发现预计外的结果时的候补措施，符合相关道德和法律标准。包括获得相关审查机构或法律机构的许可、遵守征得志愿者知情同意的原则、保存记录并对调查开放。

志愿者人体试验的类型

志愿者人体试验大致有2中类型，1是吸收、代谢和排出试验，2是耐受性试验。其他像过敏、行为、认知有时候也是可以进行。当需要了解普通人群中的特定的人群因基因倾向性原因，具有低耐受性或倾向于接触特定的添加剂的信息时，可以建议志愿者人体试验。

添加剂吸收机制和排出的人体试验可以大大增加在试验动物上做的传统化学、生物化学和毒理学方面调查预期价值。将人体试验结果和从动物上获得的结果进行比较，可以确认从动物实验获得的数据库，及得到人体和动物的显著差异，这些对解释异常和不利的发现有很大的作用。胃肠道吸收可能通过以一定时间间隔对血液水平的检测来确定，可以为生物利用度提供指示。吸收后的动力学和代谢机制信息可以通过血液和尿液检测获得。

人体试验特别适用于调查对某一物质或食物的耐受性。他们可以适用于调查一些不能在动物上调查的症状（如头痛、胃肠不适）。也可以包括身体检查、血液化学、血液病学、尿液分析和器官功能测试。同时可以检测任何不良反应，记录他们的种类、频率、强度与剂量的关系。

有很多无出版物报道了有用临床研究的信息。

f）体外试验而不是基因毒性试验

介绍

今年来，一些新的不用拿动物做实验的毒理学试验方法有了很大的进步，它们被认为“替代方法”。在食品添加剂领域，已有很多的替代方法，但是它们在可靠性和相关性上都还未被确认。然而，在欧洲替代方法证实中心（ECVAM，联合研究中心，Ispra,意大利）管理的证实程序下，确定合适的替代方法进程正在继续，并且这个任务也正式由欧盟管理下进行。

国内和国际上已经尝试证实一些体外方法可以代替活体试验。目前在遗传毒理学、光毒学和腐蚀性上的体外替代试验作为常规目的已经被国际上接受，而在其他有用的毒理学终端上的研究还待进一步发展和证实。

生物学和毒理学作用的筛选

生物学和非生物学系统都可以使用，尽管他们代表的是简化的模型，它们身上可以获得很多关于化学物可能危害的有用和潜在资料。在生物系统中，细胞培养已经广泛用于化学物质的毒物学检测，最近，还用在自然毒物（不管是来源于细菌的还是来源于植物）或从自然界中得到的化合物上。它也可能被用于新的化学物质排位在或归类在以细胞毒性为依据的参考列表。因此，至少在初步阶段被用于评估存在人体中可能存在的危害。

对于急性和亚急性分析而言，试验并不总是需要在从目标器官获得的初生细胞上进行。一个好的策略是使用来源于肿瘤、没有经过必要的分化的细胞系。由于这些模型通常很有特点并且容易掌控，因此保证了很好的结果再现性。不同的细胞系可以组合进行试验，找出最敏感地细胞系。理想的是，应该使用人源细胞，以获得感兴趣物种的信息。可以调查不同终端分别与哪些细胞基本功能相联系，如细胞活力（细胞坏死和细胞凋亡）、细胞增殖、膜损伤、形态上和代谢上的改变。大部分方法可以小型化和自动化，从而可以一次对多种物质和不同浓度进行处理。

机制研究

机制研究已经集中到生物转化研究上，它不仅可以在分离出来的肝细胞进行，而且可以在肝瘤细胞系和基因工程细胞上进行。从其他器官和组织上分离的细胞在体外试验时也展示出了不同水平的代谢能力，这可以用在特定靶器官上的毒理学研究。体外试验也可以为评估某些物质或者其相关生物转化产品在细胞核亚细胞水平的药物试验提供可能，包括特定位点作用的信息和机制的细节。

成熟的细胞功能的改变进行特定的研究，如细胞凋亡、基因表达的调节可以在原代培养或刚刚从靶器官上分离出来的新鲜细胞，或者建立能像在组织上的细胞一样能在培养基上表达特定的性能的细胞系。其中被广泛应用的主要是神经细胞、肾细胞、和角质细胞。对细胞结构或者亚细胞结构的作用的信息可以被整合，比如，在基因表达和代谢机制研究的帮助下，可以鉴定发内在相互作用的靶结构或靶分子。反过来，靶结构的鉴定可以帮助预测添加剂对主要代谢潜在影响，包括转录、蛋白质合成和蛋白质分类。这样可以为理解添加剂可能引发的不良反应及添加剂与药物、治疗或化学物质的相对兼容性提供关键信息。

建立胃肠道模型

建立胃肠道模型对食品添加剂而言可能是帮助。现在有很多的胃肠道模型，但其中最有帮助的是肠上皮细胞，包括原代培养和建立的细胞系。有了这些细胞，就有可能研究对特定功能的影响，深入了解化学物质的吸收或者作用机制。细胞能在培养基上进行分裂，那就可以研究添加剂对细胞的不同分裂阶段和培养末期细胞活性的影响。特别是有些细胞，主要是建立的源于肠内的细胞系，在渗透性过滤膜上培养时，能发生极化并形成与活体内器官类似的上皮屏障。在这些实验的条件下，细胞之前的联系一旦建立，就有可能演技物质对细胞顶部（腔部）和细胞核的影响。已有大量细胞系被应用了，其中包括Caco-2细胞、HT-29细胞核T84细胞。

g）特别研究

在一定的情况下，有必要进行一些特殊的研究，更深入探究在初始的试验中出现的特殊毒性反应、毒性反应机理、有结构活性考虑想到可能会出现特别反应，一种反应是否是物种特异性的。申请人可以自主进行这些试验并将它们作为原始档案的一部分，也可能是委员会在对档案进行初步评估后要求进行这样的试验。一旦需要要求进行特别研究或认为进行特别研究比较合适，建议向委员会咨询试验设计应该考虑到哪些方面的意见。

h）急性毒性

食品添加剂不要求进行急性毒性试验。然而，因其他目的进行了这样的试验，则要将这部分提交上来。这些或其他范围的研究可能会为目的器官急性反应提供信息。若进行了急性试验，建议申请人使用哪些用到较少动物的或者不是设计到死亡的试验方法，比如OECD指导420或423。

i）皮肤和眼睛刺激和皮肤敏感

食品添加剂安全评估不要求进行这些试验，并且它们与食品添加剂安全也是无关的。

文献参考（37-42页）