内毒素测定方法
内毒素测定方法
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》
来源--中华人民共和国药典2005年版附录? E
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250?干烤至少30分钟，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0-8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的PH值，可使用酸、碱
溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。酸或碱溶液须用检查用水
在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定: L=K/M
式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示;
K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg?h)表示，注射
剂K=5E U/(kg?h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg?h)，鞘内用注射剂K=0.2
EU/(kg?h)。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg?h)、mg (kg?h)或U/ (kg?h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必
要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的
最大倍数，在不超过此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:
MVD=CL/λ
式中L为供试品的细菌内毒素限值;
C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以
EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U /ml。如供试品为注射用无菌粉末
或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效浓度C=λ/L。
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的
标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。
鲎试剂灵敏度复核试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成
2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取含有分装了0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，及每一个浓度平行做4管;另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37??1?适宜恒温器中，保温60分钟?2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180?时，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性;形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).
λc=1g-1(?X/4)
式中X为反应终点浓度的对数值(1g)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。
Es= 1g-1(?Xs/4)
Et= 1g-1(?Xt/4)
式中Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(1g)。
当Es在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5 Es和2 Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供
试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
注:A 供试品溶液;B干扰试验系列;C鲎试剂标示灵敏度的对照系列;D阴性对照。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
1)凝胶限量试验
按表2制备溶液A、B、C、D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2 凝胶限量试验溶液的制备
编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数
A 无/供试品溶液 2
B 2λ/供试品溶液 2
C 2λ/检查用水 2
D 无/检查用水
2
注:A供试品溶液;B供试品阳性对照;C阳性对照;D阴性对照。
结果判断保温60分钟?2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。
若溶液A的两个平行管都为阴性，判供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定;否则判供试品不符合规定。
2)凝胶半定量试验
本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。依表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ-2λ之间，试验有效。
系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度(按公式CE=1g-1(?X/2))。如果试验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。
如试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于λ(如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于λ乘以该供试品的最低稀释倍数)。如果结果都为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。
表3 凝胶半定量试验溶液的制备
注:A:没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。用检查用水进行2倍系列稀释，从通过干扰试验的稀释倍数开始再稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，但随后的稀释也不得超过MVD;
B:含2λ浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照);
C:含2λ、1λ、0.5λ和0.25λ浓度标准内毒素的检查用水系列;
D:阴性对照。
方法2 光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反映混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度和透光率)之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点
显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。
光度测定试验应在特定的仪器中进行，温度一般为37??1?。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液，并制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不得大于10)，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照在设定的时间内不发生反应，将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应该大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。
干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。每种溶液至少做2个平行管。
表4 光度测定法干扰试验的制备
编号内毒素浓度配制内毒素的溶液平行管数 A 无供试品溶液不少于2个B 标准曲线的中点(或附近点)的浓度(设为λm) 供试品溶液不少于2个 C 至少3个浓度(最低一点设定为λ) 检查用水每一浓度不少于2个 D 无检查用水不少于2个
注 A:稀释倍数未超过MVD的供试品溶液。
B:加入标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。
C:如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。
D:阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率(R)。
R=(CS-Ct)/λm×100%
当内毒素的回收率在50%~200%之间，则认为在此该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围时，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并要重复干扰试验来验证处理的有效性。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
按“光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效:
(1)系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求。
(2)用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%-200%的范围内。
(3)溶液D在规定的时间内不发生反应。
若供试品溶液所在平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数和浓度后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。
(注:本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。)
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中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》
中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
内毒素法
细菌内毒素检查法标准操作规程 1 目的 建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。规范细菌内毒素检验操作，确保检验数据的准确性。 2 范围 适用于细菌内毒素的检验操作。 3 职责 3.1 质量控制部检验人员对具体操作负责； 3.2 质量保证部负责监督本规程的执行。 4 定义 无 5 内容 5.1 概述与原理 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 基本原理：鲎试剂是鲎血液细胞提取物的冻干品，主要包含4种成分，分别是C 因子、B因子、凝固酶原和凝固蛋白原。细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化其中的C因子，使鲎试剂发生一系列的酶联反应，最终形成凝胶或使凝固酶活化某些外加的显色集团（显色法）的原理，来检测细菌内毒素的量。 细菌内毒素的活性单位有两种表达方式，即EU和IU。美国、中国和日本扥国家使用EU，欧洲地区使用IU。在活性量值上，1EU=1IU，计算是可以互换。 5.2 仪器与用具 5.2.1 电子天平、电热干燥箱、时钟、水浴锅、温度计、试管架、漩涡器、剪刀、无菌封口膜、无热原吸头、试管、砂轮、移液枪，75%乙醇、木棉等。 5.2.2 细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品按级别分为国际标准品、国家标准品和工作标准品。其中，国际标准品是由WHO制备，在世界范围内进行效价的协作标定，主要用于世界各国标定各自国家的标准品之用，细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。在细菌内毒素检查试验中，应使用细菌内毒素国家标准或细菌内毒素工作标准品。 5.2.3 细菌内毒素检查用水：内毒素含量小于0.015EU/mL（凝胶法），且对内毒素试验无干扰作用。 5.2.4 鲎试剂：一批新的鲎试剂在首次使用时要先进行灵敏度复核，结果符合药典规定后，方可用于后续试验。制备或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂试验。
细菌内毒素检查标准操作规程..
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
细菌内毒素检查法---------------操作规程
******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素
******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
细菌内毒素的检测
细菌内毒素的检测 摘要:本文研究了注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素的检测。 本文是在通过调查大量的科技文献的基础上，按照中国药典2000版二部附录XI E细菌内毒素检查法所规定的试验方法而进行的。实验方案是根据注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠的细菌内毒素限度，并结合现有的实验条件而确定的。注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠(Cefoperazone Sodium and Tazuobatanna)为头孢类抗生素头孢哌酮与β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦钠组成的复方注射用无菌粉针，在临床上用于治疗下呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、腹腔盆腔感染、以及其他感染。质量标准[国家食品药品监督管理局标准（试行）YBH0538 2003]中控制热原的方法仍为家兔热原法，鉴于家兔热原法有影响因素复杂、操作繁琐、检验成本高等缺点，而用细菌内毒素检查法来控制产品中的热原具有操作简便快捷、检验灵敏度高等优点[1]。为了在大范围内开展本品的细菌内毒素检查，我们对本品进行了细菌内毒素检查凝胶法的研究。本品细菌内毒素限值为0.15Eu/ml，在1.667至0.400mg/ml的浓度范围内，本品对细菌类毒素与鲎试剂的反应无干扰。我们对3批样品进行了检验，并与家兔热原法进行对比，结果一致都为阴性，认为本品可用细菌内毒素检查凝胶法代替家兔热原法。
关键词：注射用头孢哌酮钠他唑巴坦钠细菌内毒素鲎试剂灵敏度复核试验干扰预试验干扰实验热原检查 0引言 细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁层的脂多糖，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。(附图1) 附图1 内毒素脂多糖结构示意图 <一>、O—特异性链：位于脂多糖分子最外层的多糖链，是由3—5个单糖（一般不多于25个）连成为一个多糖链。其单糖包括戊糖、氨基戊糖、已糖、氨基已糖、脱氧已糖等，单糖的种类、位置和排列顺序和空间构型，因菌种不同而异。因此，它决定菌体热原的特异性。
如何去除内毒素
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持续30min，即可去除内毒素。 3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估（1）制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。按内毒素测量方法检测这些溶液。（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。（每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE）。（3）将玻璃器皿置放烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃下，干烤30min。（4）加入适量的LAL水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。当内毒素含量至少减少了3—log时，该方法有效。必要时，重复操作，去除内毒素。用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3—log。（例如，1000 IEU和10000 10EU）数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。3、对照阴性对照：用只盛有LAL水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素质量。 3.2.3质控与提示（1）保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。（2）用含100EU的内毒素过行的检测，可用来确定去内毒素的效率。用含10000EU的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。（3）如果如果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。（4）其他技术适用于培养基的内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。选取有效的滤过膜，确保去内毒素后，培养基的营养成分不丢失并且内毒素含量下降3—log。
中华人民共和国国家标准细菌内毒素检测方法
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量
加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
去内毒素实验方法介绍
去内毒素质粒提取Protocol 内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。 图1. 内毒素结构图。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。 内毒素如何测定？ 历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。 LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol 常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。或者omega、天根等。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。 如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。 1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。 2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。 3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。 4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。 5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。 6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。 7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。 8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。 9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。 10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。 11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。 12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。
内毒素LAL检测使用说明(中文版)
Page 1 前协议 定量检测协议 ToxinSensor?显色 LAL 内毒素检测试剂盒 执行所有的测试步骤，在室温下。操作前请使用认证的内毒素免费产品。 样品制备 所有材料或稀释剂用于标本收集和准备，测试试剂必须无内毒素。在任何时候都使用无菌技术。待测样品必须存储在所有细菌活动受阻的方式中。 例如，样品之前使用，24 小时内可以存储在 2-8 ° C，但长期使用需要冻结。 pH 溶解或稀释试样用 LAL 试剂水。 由于 LAL 内毒素反应是依赖 ph的，故样品的 pH 值应为 6-8，确保良好的线性度。因此，如有需要，我们推荐使用氢氧化钠 (0.1 N，溶解在LAL试剂水中) 或盐酸 (0.1 N，LAL 试剂水稀释)调pH 值。 I.试剂制备、 鲎试剂溶解物 (LAL) 再造冻干裂解液加 1.7 毫升 LAL 试剂水。轻轻打旋每个组成30 秒，避免起泡。再造裂解液如果存储在-20 ° C，可以保持稳定一周，不推荐tonger 存储。
避免反复冻融。 Page 2 继续ToxinSensor? 显色 LAL 内毒素检测试剂盒 显色底物 重建衬底加入1.7 毫升 LAL 试剂水浓度至~ 2 mM。一旦重建，底物溶液存储在2-8 ° c可以保持稳定一个月。防止底物溶液长时间直接接触光。 终止液 重组颜色稳定剂 #1 （终止液）用 10 毫升的缓冲液。重组终止液如果存储在 2-8° c可以保持稳定一周。 重组颜色稳定剂 #2 和 #3 : 每个添加 10 ml LAL 水。每个重组液在 2-8 ° c下可以保持稳定一周。 标准内毒素的溶液 此试剂盒中提供的冻干的内毒素标准量应参考内毒素标准液瓶上的标签。 加 2ml的 LAL 试剂水溶解冻干的内毒素。 涡漩充分混匀 15 分钟以获得内毒素贮备液。重组后的内毒素贮备液若存储在 2-8 ° C可保持稳定一周 请不要冻结内毒素贮备液。 Page3 II。试剂制备，继续准备 1 EU/ml 内毒素溶液，使标准系列稀释。
去内毒素的方法及检查方法
去内毒素的方法及检查方法 注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。 热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。 【相关链接】热原的危害 一、热原的性质及除去热原的方法 1．高温法 热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。 2．吸附法 热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。 3．超滤法 热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法 热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。 5．酸碱法 热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。 6．其它 包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。 二、热原的检查方法 《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。 1．热原检查法 由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。 《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题重点
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题 摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。 一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤 对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。 1、细菌内毒素限值的确定 一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。 研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。 样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。 内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。 大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考
细菌内毒素检查验证方案
细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人：
批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表
4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。
内毒素测定方法
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》 来源--中华人民共和国药典2005年版附录Ⅺ E 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。定量测定用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少30分钟，也可用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0-8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲剂调节PH值。酸或碱溶液须用检查用水在已去除内毒素的容器中进行配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定： L=K/M 式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg?h)表示，注射剂K=5E U/(kg?h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg?h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg?h)。 M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg?h)、mg (kg?h)或U/ (kg?h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。 确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD： MVD=CL/λ 式中L为供试品的细菌内毒素限值； C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U /ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，计算供试品的最小有效浓度C=λ/L。 λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。 方法1 凝胶法
内毒素清除剂使用说明
内毒素清除剂使用说明 货号：E1040 规格：20ml/100ml 保存：4℃半年有效，-20℃长期储存。 产品简介： 内毒素清除剂主要用于清除DNA、蛋白质或其他液体样品中的内毒素。在特定的pH值、盐浓度和温度条件下，内毒素清除剂能与DNA、重组蛋白以及液体样品中的内毒素特异性结合，经过室温高速离心后，DNA或蛋白质等保留在水相，而内毒素则被浓缩到极小体积的下层相而被清除。经过3次以上重复抽提后可将活性为5000～50000EU/ml的内毒素水平降低到5～0.5EU/ml以下，即降低1000～10000倍。 操作步骤： 提取前请将内毒素清除剂放在冰上冰浴5min，期间翻转瓶子数次使试剂均匀预冷。 1、a)已纯化的质粒DNA内毒素清除：吸取500μl DNA溶液于微型离心管，加入1/10体积3M NaAc pH5.2或1/20体积5M NaCl溶液，冰浴5min。 b)在提取质粒DNA过程中清除内毒素：以碱裂解法提取质粒为例，在加入裂解液和中和液并离心去除碎片之后，吸取含质粒DNA的上清于新离心管中，冰浴5min。 2、加入1/5体积预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊。
3、冰浴5min，溶液应变清亮。 4、37℃水浴5min，不时振荡，溶液又变浑浊。 5、12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。 6、将含DNA的上层水相转移到新管，弃油状相，重复抽提三次，即重复步骤2-6三次。 7、加入 2.5体积无水乙醇，-20℃沉淀30min或过夜；12000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min弃上清；空气干燥沉淀，加入100～200μl无内毒素的高纯水或TE溶解沉淀。 8、用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性，并与初始样品比较。 注意事项： 1、DNA浓度>1mg/ml时清除内毒素效率降低。由于DNA和蛋白质本身的性质，清除程序可导致10-20％的DNA丢失，所幸的是与清除内毒素的艰难相比DNA更容易提取制备。 2、所有溶液应用无内毒素的高纯水配制，所有器械材料均应不含内毒素，玻璃器皿可高温烘烤，非挥发性水溶液可高压120℃高温处理。 相关试剂： D1140无内毒素质粒小量提取试剂盒 D1150无内毒素质粒大量提取试剂盒 12100DMEM(H)