烟草瞬时转化doc资料

烟草瞬时转化

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本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：

一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：

A、实验步骤：

1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，

并转化农杆菌。

2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，

200rpm过夜。

*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。

3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。

4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。

5、重复步骤4。

6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。

7、室温放置1~4小时

8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。

9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。

*使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。

B、试剂：

Induction medium：

MES-KOH PH 5.7 10nM

MgCl2 10mM

AS 200uM

推荐提前配制母液

1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。

1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。

0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。

用高压灭菌的超纯水稀释。

C、关于表达时间：

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烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。烟草遗传转化实验实验目的

亚细胞定位之烟草转化方法

本氏烟草（N. benthamian）瞬时表达及相关实验方法：一、农杆菌介导的烟草瞬时转化： A、实验步骤： 1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。 2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃，200rpm过夜。 *估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD，否则会影响转化效率。 3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时，1000g，5min离心收集农杆菌。 4、用2ml Induction medium（without AS）轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。 5、重复步骤4。 6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。 7、室温放置1~4小时 8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液（组合详见下文）。 9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6~8周大的本氏烟草叶片中。 *使用注射器时注意安全，防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。B、试剂： Induction medium： MES-KOH PH 5.7 10mM MgCl210mM AS 200uM 推荐提前配制母液 1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。 0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），-20℃。用高压灭菌的超纯水稀释。 C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。 D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间。过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。

白肋烟烟碱转化株鉴定规程

白肋烟烟碱转化株鉴定规程 1 范围本标准规定了白肋烟烟碱转化株的鉴定及烟碱转化株的判定指标。本标准适用于白肋烟育种和原原种繁育时烟碱转化株的鉴定。 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 21138 烟草种子 YC/T 367-2010 烟草种子雄性不育系种子生产技术规程 YC/T 383-2010烟草及烟草制品烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明和假木贼碱的测定气相色谱-质谱联用法 3 定义下列术语和定义适合于本文件。 3.1 转化株 converter 烟株群体中具有烟碱去甲基酶活性，进而具有烟碱向降烟碱（去甲基烟碱）转化能力的烟株。 3.2 鉴定 identification 对烟株是否为转化株进行定性判断并对转化株的转化程度进行定量描述。 3.3 烟碱转化率 nicotine conversion rate 烟叶中降烟碱含量占烟碱和降烟碱含量之和的比例。

4 转化株鉴定技术规程 4.1 种源获取用于通过转化株鉴定进行品种改良的亲本种子和原原种繁育的种子质量应符合GB/T 21138对种子质量的规定。 4.2 鉴定时期转化株鉴定宜在育种材料或制种田亲本烟苗移栽后(28~42)d 进行，应在开花前完成烟碱转化株的鉴定。 4.3 烟株标记选择生长正常、健康无病烟株，按单株编号挂牌标记。 4.4 单株取样摘取挂牌标记烟株大田生长期28d 以上的下部烟叶一片，在叶基部采用胶带或栓牌标记，编号与烟株相同，每片烟叶代表一株烟株。所有叶片挂在木竿、铁丝或绳索上，叶片间隔（4~6）cm ，待处理。 4.5 转化性状的诱导 4.5.1 诱导剂及浓度要求。应选择0.3%乙烯利水溶液或1%碳酸氢钠水溶液。 4.5.2 处理方法。宜用喷雾装置对叶片正面和反面进行喷洒，使叶片充分湿润。 4.5.3 保湿晾制。用塑料薄膜覆盖处理后的烟叶，或将处理后的烟叶置于相对湿度为 70%~90%的环境中晾制，温度应不低于20 ℃，晾制时间为(3~4)d ，待叶片充分变黄，即处理完毕。 4.6 样品生物碱测定和烟碱转化率计算 4.6.1 烘干、磨碎样品，用气相色谱法测试样品中烟碱和降烟碱的含量，测试方法按YC/T 383-2010执行。 4.6.2 按公式（1）计算烟碱转化率。 100?+= B A A C (1) 式中： C----烟碱转化率，用百分数（%）表示； A----烟叶中降烟碱的含量，用百分数（%）表示；

实验烟草中提取烟碱

实验三、从烟草中提取烟碱内容：P93-96和P42-44 一、实验目的（明确） 1、学习从烟草中提取烟碱的基本原理和方法。 2、初步了解烟碱的一般性质。 3、掌握水蒸汽蒸馏的操作技术。二、实验原理（介绍）烟草中含有多种生物碱，除主要成分烟碱（约含2 ~ 8 %）外，还含有去甲烟碱、假木烟碱和多种微量的生物碱。烟碱又名尼古丁，是由吡啶和吡咯两种杂环组成的含氮碱，其结构式如右图：烟碱能与HCl 结合生成烟碱盐酸盐（弱碱强酸盐）而溶于水中，在此提取液中加入强碱NaOH 后，可使烟碱游离出来。 + HCl → 游离烟碱在100℃左右具有一定的蒸气压。因此，可利用水蒸气蒸馏法分离提取。由烟碱的结构可知，烟碱具有碱性，它不仅可以使红色石蕊变蓝，还可以使酚酞试剂变红，并可以被KMnO 4溶液氧化生成烟酸，与生物碱试剂作用产生沉淀。附：水蒸气蒸馏原理（见书P46）三、实验仪器与试剂（要求学生认真检查） 1. 仪器长颈圆底烧瓶（250 mL ）圆底烧瓶（100 mL ）直形冷凝管电热套玻璃棒试管止水夹蒸汽导管（导入、导出）烧杯（100 mL ）球形冷凝管接液管 T 形管滴管洒精灯锥形瓶（100 mL ）量筒（100 mL ） N N CH 3

2.试剂烟叶（或烟丝） HCl溶液10 % NaOH 40 % KMnO4 % 酚酞 % Na2CO3 5 % 苦味酸（饱和） 3. 其它红色石蕊试纸沸石四、实验内容（简单介绍） 1、烟碱的提取取一支烟，拨去外纸，将烟丝置于100 mL圆底烧瓶内，加入20 mL10％HCl溶液，安装好回流装置，回流20 min。（如图3. a）将反应化合物冷却至室温，在不断搅拌下慢慢滴加40％NaOH溶液，使之呈明显碱性（用红色石蕊试纸检验）。按图3. b安装好水蒸汽蒸馏装置。通入冷却水后，用电热套加热水蒸汽发生器，当有大量水蒸汽产生时，关闭T形管上的止水夹。收集约10 mL提取液后，先打开止水夹，再停止加热[2]。待体系稍冷却，关闭冷却水。 2、烟碱的性质检验（1）碱性试验：取10滴烟碱提取液，加入1滴%酚酞试剂，振摇并观察现象。另取1滴烟碱提取液在红色石蕊试纸上，观察试纸的颜色变化。解释上述现象。（2）氧化反应：取20滴烟碱提取液加入1滴％KMnO4溶液和3滴5％Na2CO3溶液，摇动试管，于酒精灯上微热，观察颜色是否变化，有无沉淀生成。（3）与生物碱的反应：取10滴烟碱提取液，逐滴加入饱和苦味酸，边加边摇动，观察有无黄色沉淀生成。图3. a 回流图3. b水蒸气蒸馏五、注意事项（强调） 1、电热套温度控制。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL；轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基，或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养一、实验原理与实验步骤在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。植物材料：烟草植株药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子二、实验方法与步骤

注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。（2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。三、培养基配制和灭菌本次实验使用（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

烟草瞬时转化相关文献

Systemic Agrobacterium tumefaciens–mediated transfection of viral replicons for ef?cient transient expression in plants Sylvestre Marillonnet 1,2,Carola Thoeringer 1,2,Romy Kandzia 1,Victor Klimyuk 1&Yuri Gleba 1 Plant biotechnology relies on two approaches for delivery and expression of heterologous genes in plants:stable genetic transformation and transient expression using viral vectors.Although much faster,the transient route is limited by low infectivity of viral vectors carrying average-sized or large genes.We have developed constructs for the ef?cient delivery of RNA viral vectors as DNA precursors and show here that Agrobacterium–mediated delivery of these constructs results in gene ampli?cation in all mature leaves of a plant simultaneously (systemic transfection).This process,called ‘magnifection’,can be performed on a large scale and with different plant species.This technology combines advantages of three biological systems (the transfection ef?ciency of A.tumefaciens ,the high expression yield obtained with viral vectors,and the post-translational capabilities of a plant),does not require genetic modi?cation of plants and is faster than other existing methods. Viral vectors designed for expression of recombinant proteins in plants hold great promise because of high absolute and relative yields,and because of the speed provided by transient expression.Most of the results of practical interest achieved so far have been obtained with vectors built on the backbones of plus-sense RNA viruses such as tobacco mosaic virus (TMV)or potato virus X 1–4. We have recently shown that TMV-based vectors can be delivered to plant tissues using A.tumefaciens 5(agroinfection).However,one step of this process,namely the formation of active replicons from the primary nuclear transcript,is inef?cient.In a standard leaf transfec- tion experiment,this inef?ciency is masked by the subsequent ability of the replicons to move to neighboring cells by cell-to-cell movement.Here we show that this bottleneck can be fully remedied by incorpora-tion of silent nucleotide substitutions into the vector and by addition of multiple introns.We demonstrate that such modi?cations provide for ef?cient processing of the DNA information into active replicons in almost all cells (as high as 94%)of Nicotiana benthamiana ,an up to 1,000-fold improvement over nonoptimized TMV-based vectors,and an even higher improvement (4106-fold)in Nicotiana tabacum (tobacco).Finally,we show that the resulting vectors allow the development of a fully scalable and versatile whole-plant transfection protocol,that we term magnifection,for production of heterologous proteins in plants. RESULTS Viral replication following agroin?ltration of TMV-based vectors Agroin?ltration of a TMV-based viral vector containing the gene encoding green ?uorescent protein (GFP)(pICH16707,Fig.1a )into N.benthamiana leaves leads to the formation of foci of GFP ?uorescence 3d post-in?ltration (d.p.i.)(shown in ref.5and in Supplementary Fig.1online).T o quantify the proportion of cells initiating viral replication,a 489-bp deletion was made within the movement protein (MP)coding sequence,resulting in construct pICH14833(Fig.1a ).Replicons derived from this construct cannot move from cell-to-cell but are able to replicate autonomously within each infected cell.Three days after agroin?ltration of pICH14833in N.benthamiana leaf (OD 600of the A.tumefaciens in in?ltration solution was 0.7),a small number of cells expressing GFP appeared (see Supplementary Fig.1online),and the same pattern was still visible 2weeks after in?ltration.By counting protoplasts prepared from the in?ltrated area (Figs.1and 2),we found that 0.6–1.6%of cells initiated viral replication. There are several reasons why RNA viral vectors might have dif?culties starting the replication cycle.First,RNA viruses,such as TMV ,replicate in the cytoplasm and never enter the nucleus,and have therefore evolved in an environment where they are not exposed to the nuclear pre-mRNA processing machinery.As a result,pre-mRNA transcripts made in the nucleus from viral constructs may not be re-cognized and processed properly.Second,viral vector constructs encode very large transcripts (B 7.6kb for the primary transcript of a viral vector containing a GFP gene),a size much larger than the average size (1–2kb)of plant genes.Moreover,in nature,large eukaryotic genes often contain numerous introns that facilitate processing and export of the pre-mRNAs from the nucleus 6.We therefore hypothesized that modi?cations of the constructs that would increase the ef?ciency of processing and export of primary transcripts from the nucleus to the cytoplasm could lead to an increase in the number of cells that would initiate viral replication.Two types of modi?cations were made: Published online 8May 2005;doi:10.1038/nbt1094 1Icon Genetics,Biozentrum Halle,Weinbergweg 22,D-06120Halle (Saale),Germany.2These authors contributed equally to this work.Correspondence and requests for materials should be addressed to Y.G.(gleba@icongenetics.de).A R T I C L E S ?2005 N a t u r e P u b l i s h i n g G r o u p h t t p ://w w w .n a t u r e .c o m /n a t u r e b i o t e c h n o l o g y

烟碱向降烟碱转化对烟叶麦斯明和TSNA含量的影响

烟碱向降烟碱转化对烟叶麦斯明和TSNA含量的影响图1 叶片和主脉烟碱转化百分率与麦斯明含量的关系图2叶片降烟碱含量与麦斯明含量的关系图3不同烟碱转化能力烟株的叶片和主脉的TSNA含量图4白肋烟叶片和主脉的降烟碱与NNN含量的关系摘要以白肋烟TN90为材料，研究了非转化株、低转化株及高转化株烟叶样品的烟碱转化程度及降烟碱含量与烟叶麦斯明和烟草特有亚硝胺含量的关系。结果表明，随着烟株烟碱转化能力的提高和烟叶降烟碱含量的增加，叶片和主脉的麦斯明含量呈线性增加。当烟碱转化率超过20%时，麦斯明含量超过了假木贼碱的含量。普通烟草属于烟碱积累型植物，烟碱含量占其总生物碱含量的93%以上，降烟碱含量一般不超过总生物碱含量的3.5%。但在栽培品种的烟株群体中，一些烟株因基因突变而具有烟碱去甲基能力，导致烟碱含量显著降低，降烟碱含量相应增加，这种具有烟碱向降烟碱转化能力的烟株被称为转化株(converter)。白肋烟群体中一般含有15%～20%的转化株，其中约一半转化株的烟碱转化率在20%以上。烟碱转化是由显性基因控制，并具有加性效应。转化基因编码形成烟

碱去甲基酶，可催化烟碱向降烟碱的转化。具有烟碱转化能力的烟株在绿叶中即可开始烟碱转化，收获前转化程度较低，调制过程的前3个星期也可发生烟碱转化，变黄末期以后转化较少。与烟碱相比，降烟碱具有较大的不稳定性，在烟叶调制和陈化过程中易发生变化形成一系列降烟碱的衍生物，主要反应包括降烟碱的氧化形成麦斯明(myosmine)，酰化反应生成一系列含有1～8个碳原子酰基的酰化降烟碱，以及亚硝化反应形成N-亚硝基降烟碱 (NNN)。麦斯明和酰化降烟碱的产生可直接改变烟叶和烟气化学成分的组成和含量，对烟叶的香味、品质产生不利影响。从群体中去除转化株是降低烟叶和卷烟中TSNA含量及提高和改善烟叶香味、品质的有效途径。烟叶降烟碱含量与麦斯明的关系目前尚无报道。在烟碱向降烟碱转化与烟叶TSNA形成关系的研究方面，Shi等人选择了30株具有不同降烟碱含量的烟株，分别测定了烟草叶片的NNN含量，发现降烟碱与NNN含量呈正比，但烟碱转化与其他TSNA含量的关系尚不明确，而且缺乏叶片和主脉之间的比较。本试验在对同一品种不同烟株的烟碱转化能力进行早期鉴定的基础上，系统研究了具有不同烟碱转化能力的烟株降烟碱含量与麦斯明和TSNA含量的关系。材料与方法

农杆菌介导的瞬时表达系统

农杆菌介导的瞬时表达系统一．溶液配制乙酰丁香酮AS 0.1M，取0.101gAS溶于5mLDMSO中，在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管，-20℃冰冻保存； MES 1M 调pH=5.6，过滤除菌； MgCl2 1M 过滤后灭菌； Kan 终浓度100mg/ml，过滤除菌。 (AS ，MES均购自泰安齐旺试剂公司) YEB过夜培养液(30ml) MES AS Kan 10mM 20μM 50μg/ mL 300μl 6μl 15μl 悬浮培养液(50ml) MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2) 酵母膏牛肉膏蛋白胨蔗糖 MgSO4·7H2O 1g/L 5g/L 5g/L 5g/L 493mg/L 二．操作步骤 1. 挑起单个农杆菌菌落，接种3mL YEB培养基（含抗生素）在200r/min，28℃摇床培养过夜，储存时间比较长的菌液可多活化两次； 2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基（含抗生素，10mM MES和20μM乙酰丁香酮），28℃摇床培养2-4h； 3. 将上述过夜培养菌液在4℃，8000g下离心6min，收集菌体； 4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。调节浓度OD600至0.5-1.0（一般需要100-150mL渗透培养液），置室温培养至少3小时，无需振荡； 5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求，一般4-5叶期，已经生长一个月左右的本生烟比较合适。一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔，然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液，从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。注意用一手指从叶片下面拖住叶片，将注射器平平地堵住针孔，不让液体从叶片边缘挤压出来。注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定； 6. 将处理过的烟草放回温室，照常管理。一般沉默发生在2-5天内； 7. 在暗室里，利用长波紫外灯（MODEL SB-100P/F,365nm）观察渗透处理过的叶片，并拍照记录叶片侵染区绿色荧光表达的变化过程。

从烟草中提取烟碱

从烟草中提取烟碱主要仪器与试剂仪器：烧杯，微型布氏漏斗，抽滤瓶，分液漏斗，圆底烧瓶，锥形瓶。试剂：干燥烟叶2g，5% NaOH溶液20mL，乙醚15mL，饱和苦味酸甲醇溶液，甲醇 1、碱处理。在25mL烧杯中加入2g干燥碎烟叶和2mL 5% NaOH溶液，搅拌10min，然后用带尼龙滤布的布氏滤斗抽滤（1），并用干净的玻塞挤压烟叶以挤出碱提取液。接着用4mL水洗涤烟叶，再次抽滤挤压，将洗涤水合并至碱提取液中。 2、醚萃取。将黑褐色滤液移入25mL分液漏斗中，用15mL乙醚分三次萃取。萃取时应轻旋液体，勿振荡漏斗以免形成乳浊液导致分层困难。上层醚相从漏斗上口倒入25mL圆底烧瓶中（2）。 3、蒸去乙醚。合并醚萃取液，在水浴上蒸去乙醚（3），并用水泵将溶剂抽干。 4、重新溶解。残留物中加入2滴水和1mL甲醇，使残渣溶解，然后将溶液通过放有玻璃毛的短颈漏斗滤入25mL烧杯中，并用1mL甲醇涮洗烧瓶和玻璃毛，合并至烧杯中（4）。 5、制备衍生物。在搅拌下往烧杯中加入2mL饱和苦味酸盐的甲醇溶液，立即有浅黄色的二苦味酸烟碱盐沉淀析出。用玻砂漏斗过滤，干燥称重，测定熔点，并计算所提取的烟碱的百分产量。此操作所得二苦味酸烟碱盐熔点：217~220℃。 6、重结晶。用刮刀将粗产物移入10mL锥形瓶中，加入4mL 50%乙

醇-水（V/V）溶液，加热溶解，室温下静置冷却，析出亮黄色长形棱状结晶。抽滤，烘干，称重，测熔点。纯二苦味酸烟碱盐的熔点为222~223℃。注释（1）滤纸在碱液中会很快溶胀并失去作用。此处宜采用尼龙滤布挤压过滤。（2）在分液漏斗中进行乙醚萃取时，应注意不时放气，减低乙醚蒸气在漏斗内的压力。此时可一手握紧上口旋塞，让漏斗倾斜下支管口朝上，另一只手打开分液旋塞放气，或者在垂直放置时打开上口旋塞放气。在分离液层时，应小心使醚层与夹杂在中间的出现在漏斗尖底部的少量黑色乳状液相分离。上层液从上口倒出，下层液从下口放出。（3）乙醚易燃。在蒸馏乙醚时应用水浴加热，不能直火加热。同时开窗通风，避免外泄的乙醚蒸气富集遇火点引燃，酿成火灾！（4）烟碱毒性极强，其蒸气或其盐溶液吸入或渗入人体可使人中毒死亡。高浓度的烟碱液操作时务必小心。若不慎手上沾上烟碱提取液，应及时用水冲洗后用肥皂擦洗。

Neon电转染操作步骤

Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等影响电穿孔效率的因素电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。 1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip), the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。 2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的 culture medium，DPBS等。 3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum and supplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。 4.Aspirate the media from cells and rinse the cells using DPBS, trypsinize the cells using Trypsin/EDTA, after neutralization, harvest the cells in growth medium with serum. 用DPBS漂洗细胞两次，加入Trypsin/EDTA消化细胞，再加入生长培养基终止消化，收集细胞。 5.Count cells to determine the cell density, transfer enough cells for Neon transfection into a 1.5 ml microcentrifuge tube or a 15 ml cornial tube and centrifuge the cells at 100-400 × g for 5 minutes at room temperature. 对消化的细胞进行计数，确定细胞的密度，取出足够转染用的细胞，转移到新的1.5 mL 或者15 mL的离心管中，100-400 × g，室温离心5min。 6.Wash the cells with DPBS by centrifugation at 100-400 ×g for 5 minutes at room temperature. 用DPBS漂洗一次，同上条件离心。 7.Aspirate the DPBS and resuspend the cell pellet in Resuspension Buffer R in a final density of 1.0 × 107 cells/mL. Gently pipette the cells to obtain a single cell suspension. 弃DPBS,用适量的Buffer R重悬细胞，使细胞密度达到1.0 ×107 cells/mL.（该密度仅适用于每个

lipo2000转染操作步骤

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

细胞转染的详细过程

细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。细胞培养在适合的培养基中。细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合：用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下：澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状