外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

【实验目的】

熟悉异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG）诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。

【实验原理】(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)

在E.coli BL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因，该基因的上游为Lac启动子，在正常条件下，大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上，抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，从而抑制了pET-15b 上T7启动子下游外源基因的表达。当培养基中存在IPTG时，IPTG与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白成为非活性形式，解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制，T7 RNA聚合酶基因表达，它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录，转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。(基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268 )

本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)。pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌（Erwiniauredovora）编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE，在Nde I和Xho I 位点克隆到pET-15b中而构建的，crtE的起始密码子（ATG）与pET-15b上的多聚组氨酸标签（His-tag）的编码序列融合。crtE基因全长906 bp，编码蛋白（包括His-tag）的分子量约为35kDa。

【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)

1.实验仪器细菌培养箱，摇床，台式离心机，微量移液器，电泳仪，电泳槽，电炉

(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装) 2．实验试剂蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液：29%丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250，40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸

3．实验材料 pET-15b，pET-15bcrtE，E.coli BL21(DE3)

【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1．将pET-15b，pET-15bcrtE分别转化E.coli BL21(DE3)，涂布在含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB培养基平板上，37℃，培养至菌落清楚。(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费基因慢病毒包装)

2．分别挑取转化pET-15b（对照）和pET-15bcrtE的大肠杆菌单菌落，接种于20 mL含100μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡培养（250 r/min）过夜。

3. 取2 mL过夜培养物分别接种到20 mL含100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,相同条件下继续培养3 h。(Q往圣科技3452125268提供免费基因慢病毒包装)

4．分别加入20 μLIPTG溶液，相同条件下，继续培养3 h。

5．分别取300 μL培养物于一Eppendorf管中，10 000 rpm离心1 min，取沉淀。

6．沉淀用20 μL蒸馏水悬浮，加入20 μL蛋白载样缓冲液，混匀，100℃煮沸5 min。

7．冷却后，剧烈震荡剪断DNA，10 000 rpm离心10 min。

8．分别取对照和工程菌样品20 μL用于SDS-PAGE分析，分离胶的浓度为12%。

9．凝胶用染色液染色1～2 h，用脱色液脱色至条带清晰。

10．比较只转化pET-15b的对照菌和工程菌蛋白条带的差异，找出外源基因编码的目的蛋白。【注意事项】(你提供质粒，我给你免费包装成慢病毒Q往圣科技3452125268) 1．为了获得较高的目的蛋白表达水平，加入IPTG诱导时的工程菌培养物的OD600最好不要超过1。(你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268)2．为了获得比较好的电泳效果，在进行SDS-PAGE分析前应剧烈振荡样品，剪断DNA以降低样品黏度，并离心去除不溶性的细胞裂解物。