LC_MS_MS法测定人血浆中阿莫西林克拉_省略_浓度及其药物代谢动力学及人体生

药物研究 LC/M S/MS法测定人血浆中阿莫西林克拉维酸浓度及其药物代谢动力学及人体生物等效性研究

中国医科大学附属第一医院(110001) 高 瞰 邢俊家

阿莫西林(amox icillin)为半合成广谱青霉素类抗菌药,具有杀菌活性强、生物利用度高、组织分布好等优点[1]。克拉维酸(clav ulanic acid)是竞争性广谱 -内酰胺酶的抑制剂,由阿莫西林和 -内酰胺酶抑制剂克拉维酸钾组成的复方制剂,在临床上的应用日趋普及。克拉维酸可以增强阿莫西林对产 -内酰胺酶菌种的抗菌活性,且对多数产 -内酰胺酶的细菌也有明显的抗菌活性,临床应用十分广泛[2]。本研究建立了快速、灵敏、适用于测定高通量样品的液相色谱质谱联用(L C/M S/M S)分析方法,用于同时测定健康受试者血浆中阿莫西林和克拉维酸的浓度,评价受试制剂和参比制剂的人体生物等效性,希望能为临床安全合理用药提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器:Q-T R A P型三重四极杆串联质谱仪(美国Applied Biosystem公司);配有ESI电源以及A na lyst数据处理软件A gilent1100高效液相色谱系统(美国A g ilent公司),包括二元输液泵、自动进样器、切换阀。

1.2 药品及试剂:阿莫西林对照品(纯度为86.2%),克拉维酸对照品(纯度为95.0%),内标5-氟尿嘧啶对照品(纯度>99%)均购于中国药品生物制品检定所;受试制剂:阿莫西林/克拉维酸钾(4 1)颗粒剂(含阿莫西林250mg,克拉维酸钾6

2.5mg,石药集团中诺药业有限公司);参比制剂:阿莫西林/克拉维酸钾(4 1)颗粒剂(含阿莫西林250 mg,克拉维酸钾62.5mg,安徽省皖北药业股份有限公司);乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件:色谱柱:A g ilent T C C18柱(5 m粒径,150 mm 4.6mm I.D.),美国A gilent公司;流动相:乙腈-0 2 mmol/L乙酸铵(10 90,v/v);流速:1 0mL/min(50%分流);柱温:35 ;进样量:20 L。

2.2 质谱条件:ESI源;离子喷射电压:4500V;温度:550 ;源内气体1(GS1,N2)压力:55psi;气体2(GS2,N2)压力:70psi;气帘气体(N2)压力:20psi;负离子方式检测;扫描方式为多重反应监测(M RM);阿莫西林、克拉维酸和内标5-氟尿嘧啶的解簇电压(DP)分别为:-52V、-30V和-48 V;碰撞能量(CE电压)分别为:-13eV、-12eV和-26eV;用于定量分析的离子反应分别为m/z364 0 m/z223 0(阿莫西林),m/z197 8 m/z135 9(克拉维酸)和m/z128 9 m/z42 0(5-氟尿嘧啶)。

2.3 样品处理方法:精密取血浆样品50mL,置1.5mL EP管中,加入内标溶液50mL,加入50mL纯水,加入200mL乙腈,涡流混合30s,离心10m in(15000r/min),取上清液20mL进样分析。

2.4 方法的专属性:取6名受试者的空白血浆50mL,除不加内标外,按2.3项下操作,得空白血浆色谱图;将一定浓度的阿莫西林/克拉维酸标准溶液和内标加入空白血浆中,依同法操作,得标准溶液色谱图;取受试者给药后收集的血浆样品,加入一定浓度的内标,依同法操作,得血浆样品色谱图。由色谱图可见,阿莫西林、克拉维酸和内标5-氟尿嘧啶的保留时间分别为2.38、2.07和2.37min;结果表明:空白血浆中的内源性物质不干扰阿莫西林、克拉维酸和内标5-氟尿嘧啶的测定。

2.5 标准曲线的制备:取空白血浆50mL,加入阿莫西林/克拉维酸标准系列溶液50mL,配制成相当于阿莫西林血浆浓度为30、90、300、900、3000、6000、9000ng/mL,克拉维酸血浆浓度为20、60、200、600、2000、4000、6000ng/ mL的血浆样品,每点为3样本。按2.3项下操作,记录色谱图;以待测物浓度为横坐标,待测物与内标的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算[3],求得的直线回归方程,即为阿莫西林与克拉维酸的工作曲线。血浆中的阿莫西林和克拉维酸的回归方程分别为Y= 0 000333X-3 5e-005(r=0 9988)、Y=0 000277X-0 00034(r=0 9975)。根据标准曲线,阿莫西林和克拉维酸在血浆中的线性范围分别为30~9000ng/mL和20~6 000ng/mL。

2.6 准确度与精密度:按2.3项下操作,制备阿莫西林/克拉维酸低、中、高3个浓度(分别为阿莫西林90、900、6000 ng/mL,克拉维酸60、600、4000ng/mL)的质量控制(QC)样品,每浓度6样本,连续测定3d,根据当日的工作曲线,计算QC样品的测得浓度,进行方差分析,计算本法的准确度与精密度。结果阿莫西林低、中、高3个浓度的QC血浆样品测定值和添加值的相对误差(RE)<1 5%,日间、日内精密度良好,RS D分别为<8 1%和<4 1%;克拉维酸低、中、高3个浓度的Q C血浆样品测定值和添加值的RE< 3 4%,日间、日内精密度良好,RSD分别为<10 0%和< 3 3%。

2.7 提取回收率:取空白血浆50 L,按2.3项下操作,制备低、中、高3个浓度(分别为阿莫西林90、900、6000 ng/mL,克拉维酸60、600、4000ng/mL)的Q C样品,每浓度3样本。同时另取空白血浆50 L,除不加标准溶液和内标外,按2.3项下操作,向获得的上清液中加入相应浓度的标准溶液50 L,内标50mL,涡流混合,进样分析,获得

相应峰面积(3次测定的平均值)。以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率,阿莫西林低、中、高3个浓度的提取回收率分别为(95 5)%,(93 8)%和(93 8)%,克拉维酸低、中、高3个浓度的提取回收率分别为(94 11)%,(90 6)%和(98 6)%。

2.8 稳定性考察:依据2.3项下方法制备Q C样品,每个浓度3样本,经室温放置6h,反复3次-80 冰冻,室温溶解、-80 冰冻,放置1个月后,测定样品浓度。结果表明:血浆样品室温放置6h(阿莫西林RE在 8 3%之内,克拉维酸RE在 11.5%之内)、反复3次-80 冰冻、室温溶解(阿莫西林R E在 11 4%之内,克拉维酸RE在 12 8%之内)、-80 冰冻放置1个月后(阿莫西林R E在 11 1%之内,克拉维酸RE在 13%之内)均稳定。

2.9 基质效应:将空白血浆换成流动相,其余步骤按2.3项下操作,进样20 L,进行L C/M S/M S分析,获得相应峰面积。与相应浓度的Q C样品的峰面积的比值考察基质效应,结果发现在分析时间内,没有基质抑制或增强待测物和内标的信号。

3 阿莫西林克拉维酸颗粒人体药物代谢动力学研究

3.1 受试者及给药方案:选择健康男性受试者22名(年龄21~25岁,体质量56~72kg,身高169~182cm),签署知情同意书,于试验前在医院接受全面的身体检查,于试验前2周内未使用任何药物。受试者于服药前禁食12h。

采用2种制剂2周期随机交叉方法。22名受试者随机分成2组,分别空腹服受试制剂(含阿莫西林250mg,克拉维酸钾62.5mg)或参比制剂(含阿莫西林250mg,克拉维酸钾62.5mg),2次服药间隔时间为1周。受试者空腹12h后,于服药前(0h)和服药后0.25、0.50、0.75、1.0、1 5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0h采集静脉血4mL,置肝素试管中,离心(3500r/min)10min,分离血浆,保存于-80 冰箱中,冷冻待测。

3.2 药物代谢动力学参数:22名健康受试者口服阿莫西林250mg和克拉维酸钾62.5mg后,采用BA PP2.0软件计算药物代谢动力学参数,见表1,2。

表1 阿莫西林的平均药物代谢动力学参数( x s)

项目T max(h)C ma x(ng/mL)AUC0~ (ng h-1 mL-1)T1/2(h)参比制剂0.81 0.175494 115915181 251 1.91 0.27受试制剂0.80 0.185411 102214974 2667 1.93 0.27

表2 克拉维酸的平均药物代谢动力学参数( x s)

项目T max(h)C ma x(ng/mL)AUC0~ (ng h-1 mL-1)T1/2(h)参比制剂0.74 0.14705 1981400 461 1.87 0.32受试制剂0.68 0.19693 2341441 410 1.97 0.54

3.3 相对生物利用度和生物等效性评价:根据每名受试者口服受试制剂和参比制剂后AU C0-t,求得受试制剂的相对生物利用度。单次口服受试制剂后阿莫西林的相对生物利用度为(99 9)%;克拉维酸的相对生物利用度为(107 28)%。

采用BA P P2 0软件,将单剂量口服受试制剂和参比制剂的A U C0-t、AU C0~ 、C m ax经对数转换后进行方差分析。再采用双单侧t检验法和(1–2 )置信区间法对受试制剂和参比制剂的生物等效性进行评价,数据显示, lnA U C0-t和lnA U C0~ 的90%置信区间均在等效性标准规定范围80%~125%内;lnC m ax的90%置信区间均在等效性标准规定范围70%~143%内。统计分析结果表明:2种制剂具有生物等效性。阿莫西林和克拉维酸的T max通过非参数检验(W ilco xo n符号秩检验)得到S分别为80和49,分别大于查表所得的S0 05(18)=40和S0 05(16)=30。结果表明:受试制剂与参比制剂T max差异无统计学意义(P> 0 05)。

4 讨 论

在进行正离子方式和负离子方式方法探索时发现,阿莫西林和克拉维酸的负离子化效率均远远高于正离子形式;试验中同时对ESI源和A PCI源进行了考察,结果发现ESI源条件下可产生较高的灵敏度和响应值,因此选用ESI 源及负离子模式。由于待测物含有两性基团,所以乙酸铵的加入增加了流动相的缓冲能力。由于2种分析物均是极性很大的化合物,亲水性很强,如果有机相的比例过大,待测物就不容易在色谱柱上保留,很容易被流动相洗脱下来,并且考虑到色谱柱使用的有机相比例范围,所以选择的有机相与水相的比例为10 90。

由于阿莫西林和克拉维酸结构中均含有 -内酰胺环,所以对热不稳定,如果采用液液萃取法,氮气吹干过程会使阿莫西林和克拉维酸降解,并且阿莫西林和克拉维酸极性较大,极易溶于水,所以液液萃取法不适用于本实验;对于固相萃取法,我们尝试了Cleanert O DS-N-SPE-C18和O DS-C18(A gela T echnolog ies Inc.中国)2种固相萃取小柱,虽然阿莫西林和克拉维酸能够在这2种固相柱上保留,但是样品的回收率不高,无法满足灵敏度的要求,并且由于固相萃取的成本较高,操作也相对复杂,该样品处理方法也未能应用于本实验中。我们还尝试了蛋白沉淀后反提法,虽然该法适用于极性较大的物质的提取,可是样品的提取回收率也较低,并且步骤很复杂,也不予采用。相对而言,蛋白沉淀法操作简单、重复性好,更适合于本研究。用4倍血浆体积的乙腈沉淀蛋白,可以使血浆中的蛋白沉淀完全,大大地减少了基质效应。提取回收率结果显示,血浆中阿莫西林的提取回收率稳定在93%左右,克拉维酸为94%左右,可见,此方法提取回收率稳定且较高,是较优的前处理方案。

参考文献

[1]何解生,章静.阿莫西林/克拉维酸钾的临床应用.海峡药学,

2006,18(2):136.

[2]梁再赋.国内阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂的现状.国外医

药抗生素分册,2006,8(2):96.

[3]钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问

题.药物分析杂志,1996,16(5):343-346.

(收稿日期:2011-03-11)作者简介:高瞰,女,1982年10月生,助教,中国医科大学附属第一医院,110001

强力天麻杜仲软胶囊的质量控制首都医科大学附属北京佑安医院(100069) 尼富苓

中国中医科学研究院 柏 冬

强力天麻杜仲软胶囊由天麻、杜仲(盐制)、制草乌、附子(制)、独活、地黄等十二味药组成,具有散风活血,舒筋止痛的功效,为强力天麻杜仲胶囊的改剂型制剂,它崩解时限短,体内吸收快,保证了有效成分的充分利用。天麻系方中君药,天麻素为主要有效成分之一,且含量较高。为有效控制其质量,笔者采用薄层色谱法(T L C)对方中制草乌、附子、独活、地黄进行定性鉴别,并采用高效液相法(H PL C)定量研究天麻中的天麻素的含量,以此建立的质量控制方法可用于强力天麻杜仲软胶囊的质量控制。

1 材 料

HP1100型高效液相色谱仪,包括V WD检测器、H P Chemstatio n system化学工作站(美国A g illent公司);M i-l lipor e Simplicit y超纯水器;超声波清洗器(型号: SK5200H,功率150W,频率20kHz,上海科导仪器有限公司)。强力天麻杜仲软胶囊为试验室自制;天麻素(中国药品生物制品鉴定所,批号:0807-9702)、附子对照药材、制草乌对照药材、地黄对照药材、独活对照药材均购至中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯(fisher),水为二次重蒸水,其他试剂均为分析纯。

2 质量控制

2.1 定性鉴别

2.1.1 附子、制草乌的T L C鉴别:取本品30粒取出内容物,加乙醚20mL,振摇10min后,加氨试液10mL,振摇30m in,再放置1~2h,分取乙醚层,蒸干,残渣加无水乙醇2mL使溶解,作为供试品溶液。分取附子、制草乌对照药材4g,加乙醚30mL,振摇10min后,加氨试液10mL,振摇30min,再放置1~2h,分取乙醚层,蒸干,残渣加无水乙醇2mL使溶解,作为对照药材溶液。再按处方比例,称取除附子、制草乌以外的其余药材,以拟定供试品溶液制备工艺制成缺附子、制草乌的阴性对照溶液。照T L C法[1]试验,吸取上述3种溶液各10 L,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以二乙胺 正己烷(4 1)为展开剂,展开,展距约9cm,取出,晾干,喷以改良碘化铋钾试液,日光下检视。结果在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。

2.1.2 独活的鉴别:取本品20粒取出内容物,加乙醚20 mL,浸渍过夜,滤过,滤液蒸干,残渣加氯仿2mL使溶解,作为供试品溶液。取独活对照药材2g,加乙醚10mL,浸渍过夜,滤过,滤液蒸干,残渣加氯仿2mL使溶解,作为对照药材溶液。再按处方比例,称取除独活以外的其余药材,以拟定供试品溶液制备工艺制成缺独活的阴性对照溶液。照T L C法试验,吸取上述3种溶液各2 L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-苯-醋酸乙酯(2 1 1)为展开剂,展开,展距约9cm,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。结果,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照无干扰。

2.1.3 地黄的鉴别:取本品20粒取出内容物,加甲醇20 mL,加热回流1h,放冷,滤过,滤液回收甲醇至5mL,作为供试品溶液。取地黄对照药材粉末2g,加甲醇20mL,加热回流1h,放冷,滤过,滤液回收甲醇至5mL,作为对照药材溶液。再按处方比例,称取除地黄以外的其余药材,以拟定供试品溶液制备工艺制成缺地黄的阴性对照溶液。照T LC法试验,吸取上述3种溶液各5 L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-甲醇-水(14 6 1)为展开剂,展开,展距约9cm,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸试液,105 加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。

2.2 天麻素的含量测定

2.2.1 色谱条件:色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充柱(250mm 4.6mm,5 m),流动相为甲醇-水(3 97),流速为1mL/min,检测波长为221nm,柱温为室温,进样量:10 L。在此色谱条件下天麻素与其他组分均能达到基线分离,理论板数按天麻素峰计算不低于4000。

2.2.2 溶液的制备: 对照品溶液:精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36h的天麻素对照品适量,置10mL 量瓶中,加适量甲醇溶解,定容,制成每1mL含65.8 g的溶液,摇匀,即得。 供试品溶液:取本品内容物约6g,精密称定,置三角瓶中,加甲醇40mL,超声处理30min,滤过,残渣用少量甲醇洗涤,合并滤液,并转移至50mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,量取20mL蒸干至无醇味,残渣加20mL水溶解,滤取续滤液即得供试品溶液。 阴性对照溶液:另取处方中除天麻以外的其余药材按规定工艺制备成阴性样品,再按供试品溶液制备方法制备缺天麻的阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验:取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 L分别注入液相色谱仪中,按 2.2.1 项下色谱