从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导

从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导:参与JNK /ERK MAPK和PI3K / Akt通路

在本研究中，我们旨在揭示葡萄籽中低聚原花青素（OPC）对脂多糖（LPS）活化，HSC-T6，大鼠肝星状细胞系的潜在抗纤维化作用.。HSC-T6细胞在加入LPS前用OPC处理1小时，然后在指定时间内孵育。OPC抑制HSC-T6细胞的细胞活力，并减少在lps诱导的HSC-T6细胞中胶原蛋白I，α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA），金属蛋白酶I（TIMP-1）组织抑制剂在LPS诱导的蛋白表达。OPC还显着抑制LPS刺激的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（Akt），细胞外信号调节激酶（ERK）和c-Jun N-末端激酶（JNK）的磷酸化。此外，OPC预处理阻止LPS-引发的核因子κB（NF-kB）从细胞质转移到核。OPC，以及NF-kB，PI3K和JNK的特异性抑制剂可以有效抑制α-SMA和胶原蛋白I的表达。总之，我们证实了OPC的抗纤维化机制可能通过JNK / ERK MAPK和PI3K / Akt磷酸化抑制NF-kB的活化来参与HSC 活化和转分化的抑制。因此，OPC通过涉及MAPK-PI3K / AKT途径的NF-kB调节具有HSC活化的潜在抑制性质。

1.介绍

肝纤维化是慢性肝炎的常见病理结果，最终会导致肝硬化甚至肝癌。肝纤维化进展的特点是细胞外基质过多(ECM)沉积，包括胶原蛋白I和平滑肌肌动蛋白(a - sma) [1]。活化的肝星状细胞(HSC)在肝纤维化中起着关键作用，所以控制肝星状细的活化是抗纤维化治疗的理想靶点。[2]通过不同的刺激，静止的肝星状细胞被激活和分化，然

后由肝星状细胞产生的大量的细胞外基质(ECM)沉积于纤维组织[3,4]。在HSC激活过程中，ECM定量地和定性地增加。这些过度的ECM导致了ECM降解与生成的不平衡。因此，抑制HSC的增殖和活化是一种理想肝纤维化的治疗方法。

脂多糖(LPS)，革兰氏阴性细菌的主要细胞壁成分，是toll样受体4(TLR4)的主要配体，在许多类型的肝细胞中表达，包括Kupffer 细胞，肝细胞和HSCs。特别是,TLR4在HSC中的表达在肝纤维化中起关键作用[5]。肝损伤后,肠粘膜渗透性增加，导致内毒素易位增加[6]。虽然库普弗细胞是LPS的最佳表征靶点，但HSC也对低浓度的肠源性内毒素具有高度的反应[7]。在人肝标本分离的活化HSC中也观察到LPS诱导的核因子-κB（NF-kB）活化[8]。

NF-kB在HSC活化和纤维发生的进程中起关键作用[9]nf - kb是二聚体转录因子家族，在肝纤维化的发展过程中起着核心作用[10]。nf - kb激活发生在活化的HSCs中，nf - kb抑制剂可以有效阻断小鼠肝纤维化[11]。因此，阻断nf - kb信号通路可以抑制HSC激活，进而减弱肝纤维化。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/ Akt通路可增强NF-kB 的转录活性[12] 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K /蛋白激酶B （AKT）之间的串扰可能会调节细胞存活[13] JNK，PI3K和Akt的激活诱导具有促纤维化作用的HSC的激活[14,15]。已经使用药理学或遗传学方法建立了对HSC中PI3K / Akt信号传导的抑制，从而抑制HSC的激活[16]。因此，通过MAPK和PI3K / Akt途径靶向NF-kB 的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。因此，通过MAPK

和PI3K / Akt途径靶向NF-kB的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。低分子原花青素复合物（OPC，也称为原花青素），一类类黄酮化合物，通常从葡萄籽以及各种水果和蔬菜中获得，具有有效和广泛的药理和治疗活性[17]。OPC是一种高分子量的聚合物，包括原花青素，原花翠素类和花葵素[ 18 ]。OPC是功能强大的抗氧化剂，可以摆脱自由基。丰富的体内科学证据表明，OPC防护小鼠酒精- 四氯化碳- ，二甲基亚硝胺- 或硫代乙酰胺- 诱导的肝纤维化[19-22]。来自蓝莓V.virgatum的叶片的原花青素阻断了血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的人类HSC活化[23]，表明OPC可能是肝纤维化的潜在治疗剂。然而，OPC在抑制通过MAPK和PI3K / Akt信号传导的HSC活化的确切机制迄今尚未得到充分阐明。在目前的研究中，我们利用LPS激活的HSC体外模型来研究OPC的潜在抗纤维化作用。我们的数据表明OPC通过在纤维化过程中抑制NF-kB活化来抑制HSC转分化，并且这些事件可能由ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt 途径介导。

2.材料和方法

2.1材料

来自于伊方科技有限公司（中国天津）的葡萄籽中的OPC（纯度> 99.80％）。LPS和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma Chemicals Co.（St Louis，MO，美国）。OPC溶解于DMSO中，细胞DMSO浓度小于0.5％，不影响细胞生长[24]。抗PI3K，抗磷酸化PI3K，抗Akt 和抗磷酸化Akt抗体购自Cell Signaling Technology（Beverly，MA，

USA）。抗NF-kB p65和抗Topo I抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc.（Dallas，Texas，USA）。抗肌动蛋白和抗-α-SMA抗体购自Abcam （Cambridge，MA，USA）。JSH23（NF-kB抑制剂），Ly294002（PI3K 抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）购自Sigma-Aldrich。BCA蛋白测定试剂盒购自BeyotimeInst。生物技术。（中国江苏）。所有细胞培养物均购自Fischer Scientific。

2.2 细胞培养

将HSC-T6细胞在含有5％CO 2 -95％空气的湿润培养箱中，在含有10％胎牛血清（FBS），100单位/ ml青霉素G钠和100mg / ml 链霉素的DMEM中培养。HSC-T6是永生化的大鼠肝星状细胞系，具有原代HSC的特异性表型和功能。

2.3通过MTT法测定细胞活力

使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基咔唑溴化物（MTT）测定法测量细胞活力。将HSC-T6细胞以1×10 4个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在存在或不存在OPC的条件下处理24小时。加入MTT，然后再培养3小时。抽出含有MTT的培养基，用DMSO 代替。使用酶标仪在540 nm检测MTT对紫色番茄的减少。

2.4。蛋白质印迹分析

从HSC-T6细胞中提取总蛋白，用Western和IP的裂解缓冲液提取，用核和细胞质蛋白提取试剂盒（中国江苏省生物技术研究所）制备核和胞质提取物。通过8-12％的十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜。并

用含有5％脱脂乳和0.05％吐温20的PBS封闭膜，然后与特异性一级抗体一起温育，随后与HRP-缀合的二抗孵育。最后，用增强型化学发光（ECL）检测系统（Beyotime，Nanjing，Jiangsu，China）显现目标蛋白，并暴露于X射线胶片。用Bio-Rad Quantity One软件分析每个条带的密度。b-肌动蛋白用作加载对照。

2.5。免疫细胞化学染色

细胞在6孔板中的盖玻片上生长，然后在不存在或存在LPS的情况下用OPC处理。细胞用4％多聚甲醛固定，然后在0.1％TritonX-100中透化，然后用PBS中10％山羊血清封闭。之后，将细胞在第一抗体中在4℃下孵育过夜，然后进行FITC-缀合的第二抗体孵育。用含有DAPI（Abcam）的荧光载体培养基安装细胞，然后将Olympus BX53荧光显微镜或Olympus FluoViewTM FV10i共焦激光扫描生物显微镜显像。

2.6。统计分析

数据以平均值表示？标准差（SD）。通过单因素方差分析（ANOV A）评估统计学意义。显着性水平（P值）小于0.05。所有统计分析均使用GraphPad Prism v6软件（Graphpad Software Inc.，USA）进行。

3.结果

3.1。OPC抑制LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物

首先，我们确定了HSC-T6细胞的活力。OPC（0-40mg / ml）在24小时内浓度依赖性降低HSC-T6细胞活力（图1A）。OPC的IC50

为54.20mg / ml。LPS统计增加HSC-T6细胞活力，这与以前的报道一致[25,26]，表明LPS可以刺激HSC的活化。在LPS存在下用OPC 处理的HSC-T6细胞也表现出细胞活力下降的趋势（图1B）。据报道姜黄素通过抑制HSC活化来保护肝纤维化，并且对治疗肝纤维化具有很高的治疗意义[27,28]。正在进行一系列临床研究以研究姜黄素对人类肝脏疾病的影响（https://www.360docs.net/doc/d71325576.html,）。因此，我们使用姜黄素作为阳性对照，我们也在以前的研究中使用姜黄素作为阳性对照[29]。OPC在20和40mg / ml的共振中表现出与HSC-T6细胞中的姜黄素相当的细胞毒性，表明OPC具有HSC活力的潜在抑制特性。为了证实OPC的抗纤维化作用，我们确定蛋白M.Giang等。通过蛋白质印迹法分析胶原蛋白I，SMA和TIMP-1的表达.LPS处理增加肝纤维化标志物，如胶原I，a-SMA和TIMP-1，而用OPC预处理在LPS 治疗之前，以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的肝纤维化标志物蛋白表达增加（图2A和2B）。我们的数据证实，通过OPC抑制ECM生成可能与降低的HSC增殖有关。图1. OPC对HSC-T6细胞活力的影响。在不存在（A）或存在（B）LPS的情况下，用不同浓度的OPC 或姜黄素预处理HSC-T6细胞24小时。＃P <0.5，### P <0.001，与未处理的HSC-T6细胞相比有明显差异; *** P <0.001，与LPS处理的HSC-T6细胞相比显着不同。

3.2。OPC抑制激活的HSC-T6细胞中的ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt磷酸化

由于参与肝纤维化的MAPK信号通路的重要作用，我们分析了

OPC对JNK和ERK磷酸化的影响。用OPC（5,10,20和40mg / ml）处理30分钟，我们发现LPS刺激后磷酸化的ERK和JNK显着增强，但是通过OPC处理和浓度有效地降低了这些MAPK蛋白的磷酸化水平（图3）。为了证实OPC的抗纤维化机制是否涉及PI3K / Akt信号通路，我们进行了磷酸化和总PI3K和Akt蛋白的Western印迹分析。在LPS刺激的HSC-T6细胞中发生PI3K / Akt的磷酸化。磷酸化PI3K / Akt蛋白水平通过OPC浓度依赖性降低。

图2. OPC对LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物的影响。HSC-T6细胞在LPS激活另外24小时之前用OPC预处理1小时。（A）使用western印迹检测a-SMA，胶原I和TIMP-1的蛋白表达。（B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。*** P <0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。### P <0.001，与正常未处理的HSC-T6细胞相比有显着性差异。

图3. LPS激活的HSC-T6细胞中的ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt磷酸化。HSC-T6细胞在LPS刺激前1小时预处理30分钟。（A）通过用特异性一级抗体的Western印迹测量磷酸化和总JNK，ERK，PI3K和Akt蛋白。（B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。*** P <0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。### P <0.001，与正常未处理的HSCT6细胞相比有显着性差异。

3.3。OPC阻断LPS刺激的HSCT6细胞中的NF-kB核移位

NF-kB是LPS刺激的HSC-T6细胞中促炎介质生产中的关键上游调节因子。我们调查了OPC是否可以阻止NFkB的核易位。首先，

使用western blot检测核和细胞溶质级分中的NF-kB p65亚基。NF-kB p65在LPS刺激后30分钟内降低，而NF-kB p65表达增加（图4A和B）。核和细胞质分数的这些变化表明，HSC中的LPS刺激后，NF-kB p65从胞质溶胶转移到核。据预期，OPC成功抑制了细胞质中NF-kB p65表达的降低，核增加。我们还观察到LPS刺激后30分钟，NF-kB p65明显移位到HSC细胞核中（图4C）。然而，与LPS引发的HSC-T6细胞相比，OPC预处理显着抑制NF-kB的核易位。

3.4。靶向PI3K / JNK / NF-kB信号抑制HSC-T6细胞的纤维形态表型

图4. OPC对LPS诱导的NF-kB易位的影响。HSC-T6细胞用LPS预处理1小时，然后再用LPS处理30分钟。（A）通过western 印迹测定核（Nu）和胞质（Cy）级分中的NF-kB p65。（B）每个免疫反应带被数字化并表示为每个加载对照的比例。（C）NF-kB p65易位通过免疫荧光检测（放大倍数：200）

在LPS激活的HSC-T6细胞中包括a-SMA和胶原蛋白I的ECM 沉积的增加也通过免疫荧光证实（图5A和B）。a-SMA和胶原I完全位于HSC-T6细胞的胞质溶胶中。OPC预处理减少HSC-T6细胞中a-SMA和胶原I的阳性染色。为了验证PI3K / JNK / NF-kB信号传导可以调节HSC的纤维形态，我们将NF-kB，PI3K和JNK的抑制剂预处理成LPS激活的HSC-T6细胞。由于JSH23（NF-kB抑制剂）抑制了a-SMA和胶原I的荧光强度，Ly294002（PI3K抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）（图5A，5B，5C和5D）。通过OPC的α-SMA

和胶原I表达的相当程度等同于NF-kB，PI3K和JNK的抑制剂。它暗示着靶向PI3K / JNK / NF-kB信号调控

HSC激活和转分化，以及通过OPC对PI3K / JNK / NF-kB信号传导的抑制作用可能有助于HSC活化的抑制。

4。讨论

图5. a-SMA和胶原I对LPS激活的HSC-T6细胞的荧光分析。在LPS激活前1小时，用OPC（20和40mg / ml），JSH23（NF-kB 抑制剂，10mM），Ly294002（PI3K抑制剂，25mM）和SP600125（JNK 抑制剂，20mM）预处理HSC-T6细胞再过24小时。然后用a-SMA （A）和/或胶原I（B）免疫细胞。显示a-SMA或胶原I染色（绿色）和具有40,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的核。图片拍摄于600？放大。用Image Pro-Plus 6.0分析a-SMA（C）或胶原I（D）的绿色荧光强度。*** P <0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。### P <0.001，与未处理的HSC-T6细胞相比显着不同。

肝纤维化是由长期肝脏疾病对慢性肝损伤的伤口愈合反应引起的，如果不能很好地控制，肝纤维化将发展为肝硬化，甚至是肝癌。HSC是肝纤维化过程中ECM的关键生产者。持续的HSC活化导致肝纤维化。抑制HSC中过量的ECM合成是治疗肝纤维化的众所周知的有吸引力的方法[30,31]。低分子原花青素（OPC），一类类黄酮化合物，广泛用于葡萄种子以及各种水果和蔬菜。OPC被广泛用作对心脏恢复有积极作用的营养和膳食补充剂

和肥胖[32,33]。另外，鉴于OPC在几种动物纤维化模型中改善

动物肝纤维化，我们对OPC是否和如何调节HSC激活感兴趣。为了检测OPC是否可以降低激活的HSC的纤维化程度，我们研究了肝纤维化标记物的蛋白质表达。a-SMA和胶原I代表纤维化过程中活化的HSC的典型纤维化标志物。TIMP-1由HSC产生，可防止胶原蛋白降解，最终促进肝纤维化。目前的结果表明，肝纤维化标志物的蛋白质表达，例如A-SMA，胶原I和TIMP-1，通过OPC显着降低，表明OPC可调节ECM代谢。结合细胞活力数据，上述结果表明，通过OPC降低的ECM累积可能与细胞活力降低部分相关，从而减轻HSC活化。MAPKs是丝氨酸- 苏氨酸蛋白激酶，可以被大多数细胞外刺激激活。MAPKs介导NF-kB和PI3K / Akt信号转导。MAPKs 调节HSCs中的主要纤维化反应[34]。三种主要的MAPKs包括ERK，JNK和p38激酶。据报道，JNK活动将HSC增殖转化为细胞凋亡响应静止HSC刺激[35]。ERK的激活上调NF-kB / AP-1转录因子的活性，导致HSC活化[36]。因此，靶向JNK和ERK的药物可能具有抗纤维化活性，可能是通过NF-kB的抑制作用阻断肝纤维化进展的方法[37]。我们的数据证实ERK和JNK磷酸化在LPS激活后30分钟显着增加，并且正如预期的，通过OPC有效地降低了ERK和JNK 的磷酸化水平。

此外，我们的免疫印迹和免疫荧光染色图4. OPC对LPS诱导的NF-kB易位的影响。HSC-T6细胞用LPS预处理1小时，然后再用LPS处理30分钟。（A）通过western印迹测定核（Nu）和胞质（Cy）级分中的NF-kB p65。（B）每个免疫反应带被数字化并表示为每个加

载对照的比例。（C）通过免疫荧光（倍率：200？）检测NF-kB p65易位。678 M. Jiang et al。/生物医药和药物治疗93（2017）674-680分析证实，在30分钟内LPS激活的HSC发生NF-kB p65核易位，而OPC抑制LPS诱导的HSC中NF-kB亚基的核移位。JNK和NF-kB 的抑制剂成功地降低了位于HSC胞质溶胶中的α-SMA，胶原I的表达。这些结果暗示OPC抑制JNK / ERK磷酸化和NF-kB p65激活，OPC表现出的这些抑制活性可能有助于抑制ECM在激活的HSC中的过度沉积。PI3K是细胞内磷脂酰肌醇激酶，与各种细胞功能有关。Akt是NF-kB的上游[38]，NF-kB过表达导致Akt磷酸化[39]。PI3K / Akt信号传导的失调与肝纤维化有关。PI3K /Akt信号转导也参与ECM沉积，HSC活化和肝纤维化进展的调节。在目前的研究中，磷酸化PI3K / Akt在HSC-T6细胞中LPS刺激后高度增加，这与我们以前的结果一致[24,25]。如预期，OPC预处理成功抑制PI3K / Akt磷酸化。我们也证实PI3K抑制剂完全抑制了ECM的生成。这些数据表明，OPC的潜在抗纤维化机制可能涉及通过抑制PI3K / Akt信号来阻断NF-kB活化。我们的研究结果表明靶向PI3K / AktMAPK-NF-kB信号可能调节HSC-T6细胞的纤维形态表型，实际上OPC通过NF-kB 调控触发了PI3K / Akt和MAPK信号传导之间的复杂串扰。然而，进一步的研究需要确定OPC在已建立的肝纤维化动物模型中的体内治疗作用。总之，OPC通过降低ECM沉积来抑制HSC活化，并且该抗纤维化活性可能由MAPK和PI3K / Akt通过NF-kB调节介导。因此OPC具有抑制MAPK和PI3K / AKT途径以预防肝纤维化的潜

在治疗益处。总之，OPC的这种抗纤维化机制可能与通过激活的HSC 中的NF-kB调节的MAPK和PI3K / Akt的调节相关，OPC可能是治疗肝纤维化的潜在天然候选物。