HIV核酸检测技术2014
HIV核酸检测技术2014
实验室 1 “无模板" Lab
试剂储存 主反应混合物制备
实验室 3 “扩增后" Lab 第二轮扩增、电泳分析、 测序反应和毛细管电泳
在密闭箱中以专用加样器操作
15
三实验室布局(备选 2B)
样品
Frozen plasma Whole blood DBS
2nd round PCR set-up
实验室 2
第二轮扩增
在密闭箱中以专用加样器操作
PCR 工作站 (Dead-air Cabinets)
13
三实验室布局 (备选 2A)
样品
Frozen plasma Whole blood DBS
实验室 2 “样品处理和PCR" Lab
样品接收储存
提取和第一轮PCR反应混合
血浆中RNA量比血清中高并稳定。 全血中病毒载量非常不稳定。
EDTA抗凝的RNA比肝素、ACD好，并且肝
素对PCR扩增有抑制作用。（用ACD抗凝 的样品检测结果大约会比EDTA抗凝的样本 低15％) 采集的样品应在4～8小时以内分离血浆。
样品的保存
用于核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于
HIV核酸检测及婴幼儿诊断
HIV核酸检测的意义
早期诊断
婴儿的早期诊断：HIV感染母亲所生小于 18个月龄
的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即 可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同： 有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间 的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。 也可使用多样品集合的方法，对采供血机构的原料 血浆以及HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核 酸检测，及时发现窗口期感染，降低“残余危险 度”，减少二代传播。
艾滋病检测方法
艾滋病检测方法艾滋病，这个令人闻之色变的疾病，给人类健康带来了巨大的威胁。
及时、准确的检测对于艾滋病的防控和治疗至关重要。
接下来，咱们就来详细了解一下艾滋病的检测方法。
首先，咱们得说说酶联免疫吸附试验（ELISA）。
这是一种常用的艾滋病筛查方法。
它的原理呢，就是利用抗原和抗体的特异性结合。
简单来说，就是在试剂盒里加入被检测者的血液样本，如果血液中有艾滋病病毒抗体，就会和试剂盒里的特定物质发生反应，产生一些能被检测到的信号。
这个方法操作相对简单，成本也不太高，所以在很多医疗机构都能见到。
还有一种叫做免疫荧光试验（IFA）。
它和 ELISA 有点类似，也是通过检测抗体来判断是否感染艾滋病。
不过，IFA 是用荧光标记的抗体来检测，这样能让结果更直观、更清晰。
但这个方法对设备和技术的要求相对高一些。
快速检测试剂也是常见的检测手段之一。
这种方法的好处就是出结果特别快，一般十几分钟到半小时就能知道结果。
像胶体金法、免疫渗滤法等都属于快速检测试剂。
适合在一些紧急的、现场的检测场景中使用，比如在一些高风险人群的筛查活动中。
核酸检测也是艾滋病检测中的“利器”。
它不是检测抗体，而是直接检测艾滋病病毒的遗传物质——核酸。
这种方法非常灵敏，能在感染后的早期就检测出病毒，比抗体检测能更早发现感染。
不过，核酸检测的成本相对较高，技术要求也更严格。
除了上面说的这些实验室检测方法，还有一些家用检测试剂。
比如唾液检测试剂，使用起来比较方便，自己在家按照说明书操作就行。
但需要注意的是，家用检测试剂的准确性可能不如实验室检测，如果检测结果有疑问，还是得去医疗机构进行进一步的确认。
接下来，咱们说说检测的时间点。
一般来说，艾滋病感染后有一个“窗口期”。
在窗口期内，即使感染了病毒，也可能检测不出来。
不同的检测方法，窗口期的长短也不一样。
抗体检测的窗口期通常在感染后的 3 周左右，核酸检测的窗口期则可以缩短到 1 周左右。
如果怀疑自己可能感染了艾滋病，应该怎么做呢？首先，别慌张，尽快去正规的医疗机构或者疾控中心进行检测。
HIV-2核酸检测
附件3HIV-2核酸检测1 范围本附件规定了HIV-2核酸检测的意义、实验室要求、检测方法、结果判定及质量控制的要求，适用于具有核酸检测能力的实验室。
2 检测的意义2.1 HIV-2感染诊断当疑似HIV-2感染、HIV-2抗体确证检测结果为不确定，或者需要区分HIV-1和HIV-2感染，需要判定是否为HIV-1/HIV-2双重感染时，可以检测HIV-2核酸进行诊断。
HIV-2前病毒DNA（以下简称DNA）、RNA和总核酸（DNA/RNA）检测结果均可用于HIV-2感染诊断。
HIV-2感染者和艾滋病病人血浆中HIV-2 RNA检出率低，病毒载量水平也低，例如，一个西非的队列研究结果显示，在未接受过抗病毒治疗的HIV-2感染者和艾滋病病人中，血浆HIV-2病毒载量未检出（<10 cps/mL）的占46.5%，病毒载量为10-100 cps/mL、100-1000 cps/mL和>1000 cps/mL的分别占35.8%、11.7%和6.0%。
因此，建议优先选择检测HIV-2 DNA或总核酸。
HIV-2核酸阴性或低于检测限时，不能排除HIV-2感染。
2.2 抗病毒治疗疗效监测适用于已知HIV-2感染者和艾滋病病人。
但因HIV-2 RNA病毒载量水平低，应用价值有限。
3 实验室要求同HIV-1核酸检测和HIV-1基因型耐药检测，功能分区根据所用方法和设备的需要而定。
4 检测方法HIV-2核酸检测包括DNA定性、定量，RNA定性、定量（病毒载量）及总核酸检测。
目前我国还没有HIV-2核酸检测试剂盒获得国家药品监督管理局注册。
今后如有试剂盒获批，使用方法以试剂盒说明书为准。
以下介绍一些实验室自建方法，实际工作中可以根据具体需求选用、调整。
4.1 样本外周血单个核细胞（PBMC）、淋巴细胞富集液和全血等样本可用于HIV-2 DNA或总核酸检测，血浆样本可用于HIV-2 RNA检测。
4.2 核酸提取根据检测目的，选用不同的商品化试剂盒提取核酸，如总核酸提取试剂盒、DNA 提取试剂盒、RNA提取试剂盒。
艾滋病核酸检测
艾滋病核酸检测艾滋病核酸检测艾滋病核酸检测，直击艾滋病病毒的RNA结构，检测血液中是否存在病毒核酸，诊断有无病原体感染。
采用PCR技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂和自行研究开发设计的复合引物，覆盖常见的HIV毒株，具有很高的灵敏度。
使用二次扩增的套式PCR扩增方法，提高检测的特异性，降低假阳性的概率。
核酸检测将艾滋病病毒的检测窗口期缩短至11天，并且核酸检测这项技术目前可将乙肝、丙肝病毒的检测“窗口期”分别由原来的50天、72天缩短到25天、59天。
艾滋病核酸检测技术1、HIV基因结构HIV基因组由两条单链RNA组成，每个RNA基因组约为9.7k，在RNA5′端有一帽结构（m7G5ppp5′GmpNp），3′端有poly（A）尾巴。
HIV的主要基因结构和组合形式与其他反转录病毒相同，均由5′末端长重复（long terminal repeat，LTR）、结构蛋白编码区（gag）、蛋白酶编码区（pro）、具有多种酶活性的蛋白编码区（pol）、外膜蛋白（env）和3′末端的长重复LTR区组成。
2、核酸的提取方法核酸提取均采用磁珠法。
1）磁珠提取的原理：将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附核酸，并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中提取出来。
2）步骤：裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱3）优点：a.磁珠提取特异性高，受标本因素影响小，灵敏度高b.易于实现自动化4)缺点：a.成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动)。
b.完全手工工作，工作量太大。
3、应用套式聚合酶链反应(nPCR)检测技术根据HIV-1 gag.pol和env基因序列设计了套式聚合酶链反应(nesled polymerasechain reaction，nPCR)引物。
将外周血单个核细胞裂解液先用外侧引物扩增，其产物再经内侧引物扩增，直接走凝胶电泳判定结果。
nPCR 的敏感性。
较常规PCR高100～1000倍，可检测到0.5fg质粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血样中的HIV基因。
HIV核酸检测
HIV核酸检测核酸检测HIV核酸检测随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比P24抗原检测方法更灵敏。
简单的说就是病毒感染人体后，一般情况下可通过一系列检测被发现，而最早能被检测到的是病毒核酸。
现有的酶联免疫等血清学检测方法检测的是抗原或抗体，而核酸检测技术检测的是病毒核酸，所以能更早地发现病毒感染。
HIV核酸检测将艾滋病病毒的检测“窗口期缩短至11天，并且核酸检测这项技术目前可将乙肝、丙肝病毒的检测“窗口期”分别由原来的50天、72天缩短到25天、59天。
血液安全由此可得到更好保障。
方法及程序HIV核酸定性检测1.1 方法和试剂1.1.1 方法（1）检测方法为商品化试剂盒和实验室自建方法，商品化试剂应严格按说明书操作。
下面介绍的方法是实验室自建方法，供参考。
（2）检测血浆或血清样品使用逆转录PCR（RT-PCR）方法，建议第一轮PCR扩增使用RT-PCR一步法；检测血细胞或组织样品使用PCR方法。
一般使用扩增两轮的套式PCR方法。
（3）设立阳性、阴性及空白对照。
阳性对照为与待测样品同质、含有目的基因的样品；阴性对照为与待测样品同质、不含有目的基因的样品。
阳性和阴性对照样品应与待检样品处理程序一致。
阴性对照的设置数量应根据实验样品的数量设置在不同的位置。
1.1.2 试剂（1）PCR引物：一般使用扩增HIV gag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。
进行RNA逆转录时可使用下游特异性引物或随机引物。
引物设计可参考文献或自行设计，应尽量涵盖常见的HIV流行毒株，也可使用兼并性引物。
（2）主要试剂：包括核酸提取纯化、逆转录、PCR所需的试剂。
使用商品化核酸提取纯化试剂、逆转录酶反应试剂和PCR扩增试剂。
（3）抗污染试剂：实验室自建检测方法可使用抗污染试剂，参考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。
1.2 扩增目的基因片段1.2.1 样品的采集和处理1.2.2 核酸提取可使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。
全国艾滋病检测技术规范
全国艾滋病检测技术规范第一章样品的采集和处理1 范围本章规定了用于艾滋病病毒（HIV）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体检测、抗原检测、核酸检测、CD4+/CD8+T淋巴细胞测定和HIV分离培养。
2 规范性引用文件Guidelines for Using HIV Testing Technologies in Surveillance WHO/CDS/CSR/EDC/2001.16 UNAIDS/01.22E ISBN 9713-92-063-7.3 操作步骤3.1 样品的采集和处理艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。
唾液或尿液有时也可作为测试样品。
常用的血液样品的采集和处理方法如下：3.1.1 血清样品采集和处理3.1.1.1 用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置12h，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min离心15min，吸出血清备用。
3.1.1.2 如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。
采血后要待血样干燥后再包装送检。
3.1.2 抗凝血样品采集和处理3.1.2.1 用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。
3.1.2.2 应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD4+/CD8+T淋巴细胞测定可选用K3EDTA或肝素或枸橼酸钠，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。
3.1.2.3 用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在48h内分离PBMC和血浆，否则应在2448h内分离血浆和血细胞。
病毒载量测定不同方法对样品的要求见第四章4.1中表2；CD4+/CD8+T淋巴细胞测定样品采集要求见第五章4.1。
3.1.3 采集样品注意事项3.1.3.1 采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外）。
全国艾滋病检测技术规范(2019年修订版)
4
4.5.1样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的工作人员打开，打开包裹时应穿戴防护衣、戴口罩和防护眼镜，在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。
4.2.1.8 样品采集后处理、保存、运输的时限和条件，因不同的检测项目而异，应参见不同检测项目要求。
4.2.1.9 采血完成后的穿刺针头必须丢弃于放置尖锐危险品容器内，妥善处理，防止发生职业暴露。
4.2.2滤纸干血斑
4.2.2.1 根据需要，可将采集的各种血液样品制备成滤纸干血斑，用于检测。最常用的是用抗凝全血、末梢全血和血浆制备滤纸干血斑。
4.2.2.5 血斑充分干燥后，将其放入密封袋中，每张干血斑单独保存，避免血斑之间的相互污染，同时放入干燥剂及湿度指示卡，密封包装，保存备用。
4.2.3尿液和口腔黏膜渗出液
4.2.3.1尿液：推荐使用专用采尿管，保持尿液稳定。尿液样品可采集随机尿，女性经期应取中段尿。
4.2.3.2口腔黏膜渗出液：使用试剂盒提供的容器收集样品。存放时间和是否冻存以试剂盒说明书为准。口腔黏膜渗出液应采集口腔渗出液,不是唾液。
4.4.2.1 第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。
4.4.2.2 第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。
二○ 年 月
前 言
艾滋病在我国流行已数十年，随着感染者和临床病人的不断增加、感染人群变化，艾滋病检测工作量逐渐加大，对监测和检测的需求也不断增加，承担艾滋病检测的实验室已遍及全国各级医疗、疾病预防控制、采供血、妇幼保健机构，出入境检验检疫、军队等各个系统。为了尽早发现HIV感染者和艾滋病病人，及早提供咨询、治疗，同时为适应基层艾滋病检测工作需求，在新的形势下，根据《关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见》、《中国预防与控制艾滋病中长期规划（1998—2010年）》、《中国遏制与防治艾滋病十二五行动计划的通知（国办发[2012]4号）》、“四免一关怀”等国家艾滋病防治重要方针政策和十三五防治工作重点，在广泛征求各省、市疾病预防控制机构和医疗机构意见的基础上，在中华人民共和国卫生和计划生育委员会艾滋病专家及省级专家的参与下，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心对《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》进行修改、增补和完善，制定出《全国艾滋病检测技术规范（2015年版）》（以下简称《规范》），使其既能满足目前艾滋病检测工作的实际需求，又能体现检测技术的发展。
艾滋病病的PCR检测技术
艾滋病病的PCR检测技术PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，在艾滋病病毒的检测中起着重要作用。
本文将介绍艾滋病病毒的PCR检测技术以及其在诊断、病毒量测定和研究中的应用。
一、PCR检测技术简介PCR是由美国生物化学家基里尔·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明的一种体外扩增DNA的方法。
它通过模拟DNA在体内复制的过程，能够对少量DNA进行放大，从而便于检测和分析。
二、艾滋病病毒的PCR检测技术艾滋病病毒的PCR检测主要包括两个方面：一是检测病毒的核酸，在感染早期和晚期均可检测到；二是检测病毒的基因型，有助于了解病毒的分类和毒株差异。
1. 检测病毒核酸PCR技术可以通过特异性引物和酶来扩增病毒核酸，并通过凝胶电泳等方法进行检测。
该方法具有高度敏感性和特异性，可以检测到非常低浓度的艾滋病病毒。
2. 检测病毒基因型PCR技术可以通过特定的引物和扩增条件来扩增不同基因型的艾滋病病毒，例如HIV-1和HIV-2。
通过PCR扩增产物的序列分析，可以确定不同基因型的遗传特征和抗药性。
三、PCR技术在艾滋病病毒诊断中的应用PCR技术在艾滋病病毒的诊断中有以下几个方面的应用：1. 早期感染检测艾滋病病毒感染初期，体内的病毒数量较少，无法通过传统的抗体检测方法进行诊断。
而PCR技术则可以在感染后的数天内检测到病毒核酸，从而早期发现感染者。
2. 感染源追踪通过PCR技术检测病毒核酸，并进行基因型分析，可以追踪艾滋病病毒的感染源，了解传播途径和病毒变异情况，从而制定相应的预防和控制策略。
3. 抗病毒治疗监测艾滋病病毒的抗病毒治疗需要监测病毒的荷载量，即病毒在体内的含量。
PCR技术可以对病毒核酸进行定量检测，从而监测治疗效果，并调整治疗方案。
四、PCR技术在艾滋病病毒研究中的应用PCR技术在艾滋病病毒的研究中有以下几个方面的应用：1. 病毒变异研究通过PCR技术扩增不同基因型的艾滋病病毒，并进行序列分析，可以研究病毒的变异情况和进化规律，为疫苗研发和治疗策略提供理论支持。
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病程监控及预测
HIV感染发生后病毒载量变化具有一定规律，
这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。 因此定期进行病毒载量检测有助于确定疾病 发展的阶段，以确定相应的治疗方案
指导抗病毒治疗及疗效判定
通常在病毒载量达到一定水平后（如>35，
000～50，000c/ml）抗病毒治疗才显示良好 的治疗效果。治疗后，通过病毒水平的检测 能够确定治疗是否有效。通常在治疗6个月后 病毒水平降低0.5 log以上才被认为临床有效。
HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内
可应用HIV核酸（DNA或RNA）检测进行早 期HIV感染诊断。尽管HIV RNA检测敏感性 在感染早期较高（出生后1个月内），但是 HIV DNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒 治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼 儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰而影响早 期诊断。另外，考虑母亲血液污染因素，不 推荐使用脐带血进行HIV核酸检测。
在密闭箱中以专用加样器操作
16
试剂配制
只能在规定区域完成，配制完后，试剂必须
及时放回存放区。
核酸提取
在规定区域完成
保证无菌、实验材料无菌并一次性使用 保证无核酸酶污染
加样和扩增
只能在规定区域完成，加完后盖紧盖子并作
好标记。 操作超过10分钟时应将反应管置于冰盒内。 扩增仪预热不少于20分钟
2nd round PCR set-up
实验室 2
第二轮扩增
在密闭箱中以专用加样器操作
PCR 工作站 (Dead-air Cabinets)
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三实验室布局 (备选 2A)
样品
Frozen plasma Whole blood DBS
实验室 2 “样品处理和PCR" Lab
样品接收储存
提取和第一轮PCR反应混合
样本采集原则
样品恰当的采集、保存和运送是所有检测需
要考虑的很重要的一部分。 样品的采集和保存时，要使用无菌技术，包 括消毒管、吸头和试剂及工作环境都要防止 样品污染。
样品的采集
艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、
血浆和全血。病毒载量通常不使用全血。 血清的检测结果大约是血浆的50％（30～80 ％），可能是因为HIV病毒颗粒被包裹在纤维 蛋白网络中
遗传变异监测
可用于HIV分子流行病学监测，包括HIV-1
和HIV-2感染的鉴别诊断、HIV感染传播链 的分析、HIV基因亚型和重组病毒的鉴定和 分析以及人群HIV遗传变异趋势的监测
耐药性监测
可用于HIV耐药检测和监测，指导公共卫生
医生了解耐药性病毒株流行的态势和指导 临床医生判断抗病毒治疗效果和修改抗病 毒治疗方案。
HIV核酸检测及婴幼儿诊断
HIV核酸检测的意义
早期诊断
婴儿的早期诊断：HIV感染母亲所生小于 18个月龄
的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即 可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同： 有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间 的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。 也可使用多样品集合的方法，对采供血机构的原料 血浆以及HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核 酸检测，及时发现窗口期感染，降低“残余危险 度”，减少二代传播。
定量检测
• 按照读数报告结果，应注明使用的方法、样 品种类和样品量。 • 测定结果低于最低检测限时，应注明最低检 测限水平。低于最低检测的结果不能排除HIV 感染。 应附上仪器打印的数据。
常用的病毒载量测定方法
▰ 分枝DNA信号放大系统 HIV-1 Quantiplex ( bDNA )
▰ 逆转录PCR系统 Amplicor HIV-1 Monitor（RT-PCR） ▰ 核酸序列扩增系统 NucliSens HIV-1QT（NASBA）
亚型的检测性能 检测试剂和耗材等消耗品 对人员和实验室的要求、可操作性 样本的运输、保存、样品量 质量控制：污染控制、室内控制和室间控制 自动化操作程度 检测时间
病毒载量测定的基本要求
仪器需要按公司要求的进行定期维护
加样器的校准 水浴箱的温度校准
实验室的处理
检测实验室的分区
婴幼儿HIV感染核酸检测
2016/5/17
28
各种HIV定量检测方法的比较
Roche 技术 结果 比较 优点 RT-PCR 约2xbDNA 2.0 Bayer (前Chiron) bDNA 2.0版结果约为RT-PCR的50%， 3.0版结果与Roche 基本相同 操作时间较少 对A-G亚型有较好的反应性 Organon Nuclisens HIV-1 QT 与Roche 基本相同
滤纸干血斑样本特点（1）
需要样本量少，仅50-100μ l；
易采集，末梢血即可，适用婴儿和静脉采血
困难者； 样本安全，生物危险性低，费用低廉的运输 方式，可直接邮寄，被IATA归入最低危险水 平； 室温保存减少了保存费用，密封袋中加干燥 剂和湿度指示剂.
缺点
操作容易污染 对低值样品检测的特异性较差。 测定范围较小（相对于NASBA） 无内部质量控制，尤其在3.0版 少数生物样品反应受抑制，如精 中为单孔检测时，无法控制由于 液、乳汁和唾液 提取或加样操作的失误。 早期版本对部分亚型反应性较差， 不同版本间差异较大，2.0版约 1.0版对非B亚型的样品反应性普 为RT-PCR50%，3.0版结果与 遍较差，（5）版通过改进 Roche 基本相同表明两个版本间 对O亚型检测能力较差 差异可能达到50%。 对除血浆、血清外的大部分体液 样品无法进行检测。 对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。 标准版 (Amplicor 1.0 及 1.5) 400 - 750,000 c/mL 超敏版 (Ultra-Direct 1.0 and 1.5): 50-75,000 c/mL bDNA 3.0版: 100-500,000 c/mL
血浆中RNA量比血清中高并稳定。 全血中病毒载量非常不稳定。
EDTA抗凝的RNA比肝素、ACD好，并且肝
素对PCR扩增有抑制作用。（用ACD抗凝 的样品检测结果大约会比EDTA抗凝的样本 低15％) 采集的样品应在4～8小时以内分离血浆。
样品的保存
用于核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于
2016/5/17
30
提高敏感性的方法
▰ 增加标本用量，例如从500 µl 血浆增加到1 ml ▰ 离心沉淀病毒颗粒，离心时间从60min 延长到 80 min at 23,600 x g ▰ 减少内部定量标准的体积，例如从 25 µl 减少到 6.6 µl per lysis vial ▰ 减少沉淀的病毒重悬的体积，例如从 100 µl减 少到 55 µl ▰ 加底物孵育时间延长10–15 min
通过了 FDA认证 假阳性结果较bDNA少 1.5版对A-G亚型有较好的反应性
通过了 FDA认证 可使用多种组织，如生殖道分泌 液 对A-G亚型有较好的反应性 检测范围大 早期版本（NASBA）对部分亚 型（G亚型）反应性差。 操作复杂，样品提取(不使用自 动提取仪时)和测定反应时需要进 行大量的手工操作。 不适合一次大量检测，ECL读数 仪每次只能进行12个样品的检测。 实验内、外误差相对较大。
2016/5/17 31
假阳性(False Positive)
控制污染 物理隔离PCR前后的反应 器械专用（加样器、吸头、离心机、离心管、手 套、工作服、笔） 分装试剂 阳性和阴性对照 最近的进展 防气溶胶吸头 半自动操作 封闭试管系统（实时PCR） 全自动（样品处理＋扩增＋检测）
2016/5/17 32
实验室 2 “样品处理和PCR" Lab
样品接收储存
提取和第一轮PCR反应混合
实验室 1 “无模板" Lab
试剂储存 主反应混合物制备
实验室 3 “扩增后" Lab
1st round amplification 2nd round PCR set-up
第二轮扩增、电泳分析、 测序反应和毛细管电泳
如果不需进行nested PCR，备选 2B 更理想
实验室设置原则
明确实验室的设置原则和工作流程设计，最
终目的是为避免实验室污染。 明确实验室设置和工作流程中好的和不好的 实例。 明确我们当前实验室设置中，为避免实验室 污染有必要进行的整改。
要点：
各区必须是相互独立的，有条件各区内分别设置缓冲间，以保证不同区 之间始终完全分开。 各区的仪器设备以及各种物品必须专用。 试剂准备区和样品处理区科保持低度正压或常压，是空气始终由室内流 向室外，以避免扩增物进入此区。 扩增产物分析区保持低度负压，可安装排风扇或其他排风装置。也可以 设在远离其他各区的地方。 工作时必须遵循单一工作流向进行，工作区域必须严格遵循单一方向顺 序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和 扩增区(简称扩增区)至产物分析区。 清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试 剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其 各自的清洁用具以防止交叉污染。
1st round amplification 2nd round PCR set-up
实验室 1 “无模板" Lab
试剂储存 主反应混合物制备
实验室 3 “扩增后" Lab 第二轮扩增、电泳分析、 测序反应和毛细管电泳
在密闭箱中以专用加样器操作
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三实验室布局(备选 2B)
样品
Frozen plasma Whole blood DBS
疑难样本的辅助诊断
在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感
染与否做出正确诊断，但在特殊情况下， 单纯HIV抗体检测结果不能进行明确的诊断， 如在感染早期或疾病终末期出现抗体不确 定反应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV 感染早期或终末期的证据。由于试剂的灵 敏度、接受有效的抗病毒治疗后以及存在 长期低水平病毒的少数感染者等原因，应 对其它检测数据和样品背景情况进行综合 判断。