第5章+遗传图谱

第5章遗传图谱遗传图谱是应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上的位置的图。

遗传学技术包括杂交育种实验、人类家族的系谱分析。

1 遗传图谱的标记1.1 基因基因是首先被使用的标记。

最初的遗传图谱是在20世纪初对果蝇等生物构建的，使用基因作为标记。

一个遗传性状必须以两种替换形式或表型存在才能用于遗传学分析。

如孟德尔首先研究的豌豆茎的高或矮。

每种表型是由相应基因的不同等位基因所决定的。

起初只有那些能通过视觉区分的基因表型能用于研究。

比如，第一张果蝇遗传图显示了负责身体颜色、眼睛颜色、翅膀形态等基因的位置，这些表型都可在低倍显微镜下或肉眼观察果蝇而看到。

早期觉得这种方法很精确，但遗传学家们很快发现，只有有限的几种可见表型的遗传可用于研究，而在许多情况下，由于不止一个基因影响一个物理特征，分析起来并不太容易。

例如，到1922年，有超过50个基因被定位在4条果蝇染色体上，而其中9个基因负责眼睛的颜色，想在此领域有所贡献的每一个初涉者必须首先学会辨别果蝇眼睛的颜色是红、淡红、朱红、石榴石红、康乃馨色、肉桂色、深褐色、猩红色或深红色。

为了使基因图更加全面，有必要找到一些比可见的性状更多、更明确而且更简单的性状。

解决的方法是应用生物化学方法区分表型。

这对于微生物与人类尤为重要。

细菌与酵母只有为数很少的可见性状，因此这类生物的基因作图只能依赖于生化表型。

人类以血液分型为代表的生化标记研究从20世纪20年代就开始了。

血液分型研究不仅包括如ABO系统的标准血型，还有血清蛋白以及人类白细胞抗原（HLA系统）等免疫蛋白的等位基因可变体。

这些标记相对于可见表型的一个巨大优点是其相关基因往往为复等位基因。

HLA-DRB1基因至少有59个等位基因，而HLA-B至少有60个。

这正是与人类基因作图相关的。

与在果蝇或小鼠等生物中建立的杂交实验不同，人类基因遗传的数据只能通过检查一个家族中各成员的表型来获得。

如果对所研究的基因而言，所有的家族成员都为纯合子，就得不到有用的信息。

这对于只有两个等位基因的基因较为常见。

因为婚配偶然地发生于同一个等位基因纯合子个体之间。

而当所研究的基因有60个而不是2个等位基因时，这就很少见了。

1.2 DNA标记基因是非常有用的标记，但绝不是理想的。

特别是对于像脊椎动物及开花植物的较大基因组来说，仅依赖基因作出的图不够精细。

即使是每个基因都在图上定位，情况依然如此，这是因为在这些生物的基因组中，基因散在分布而且它们中间有大的间隙，此外基因中仅有一部分以比较容易区分的等位形式存在，从而使这一问题更为严重。

因此遗传图谱就不够全面。

故我们需要其它类型的标记。

除基因外用于作图的DNA特征称为DNA标记（DNA marker）。

与基因标记一样，DNA 标记必须有至少两种等位形式。

有三种序列特征满足此要求：1.2.1限制性酶切片段长度多态性（RFLP）RFLP（restriction fragment length polymorphism）是第一种用于研究的DNA标记。

①限制性内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是结合在DNA分子的特定序列上，并在识别序列或其附近将双链DNA分子切开的酶。

限制性内切酶有三种：I类和III类的切割位点和识别序列不存在严格的关系，而Ⅱ类限制性内切酶则在识别序列或非常接近的位置进行切割。

用限制酶处理一个DNA分子时，即产生限制片段。

如Ⅱ类限制酶EcoRⅠ(从大肠杆菌中分离得到)只在6核苷酸5’-G∣AA TTC-3’处切割。

这种序列特异性意味着用一种限制酶处理一种DNA分子总会产生同样的片段。

但对于基因组DNA来说，并不总是这样。

这是因为有些限制位点具多态性，以两种等位形式存在。

一种等位形式有正确的限制位点序列，能被酶切开；另一等位形式的序列有改变，从而该限制位点不能被识别。

后者的结果使在限制性核酸内切酶处理后，两个相邻的限制片段仍然连接在一起，从而导致了多态性。

现在已分离到2500种以上的Ⅱ类限制性内切酶，其中有300多种已在实验室种使用。

人类基因组中大约有105个RFLP。

②限制性片段长度多态性的检测为了量化RFLP，有必要在很多不相关片段的背景中判定一个或两个限制片段的长度。

这不是一个小问题，核酸内切酶如的识别序列长6bp，那么大约每46（＝4096bp）能切割DNA一次，因此如果切割人基因组DNA，可产生近750 000个片段。

所以必须采用一定技术检测特定的限制片段。

目前检测RFLP的方法主要有Southern杂交和PCR。

Southern杂交(Southern hybridization)它是用于对RFLP的第一种技术，限制性内切核酸酶酶切产生的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳而相互分离，待研究的片段是用于探针杂交检测。

其步骤如下：第一步：酶切第二步：凝胶电泳凝胶电泳是分离不同长短DNA分子和RNA分子的标准方法。

电泳是带电分子在电场中的运动。

带负电荷的分子（如DNA）向阳极移动，带正电荷的分子则向阴极移动。

电泳技术起初是在水溶液中进行的，但对DNA分子的分离来说，这样并不适用，因为在水溶液中影响迁移率的主要因素是分子形状和它所带的电荷。

而大多数DNA分子性状相同（线性），虽然其所带电荷依赖于它的长度，但由此产生的电荷差异不足以产生有效的分离。

当电泳在凝胶中进行时，情形就有所不同，此时分子形状和电荷的影响降低，而分子长度成为决定迁移率的最重要因素。

因为凝胶形成一个网状孔道，DNA分子从中穿过到达阳极。

较短的分子受孔道的阻碍较小，能够比较长的分子更快地穿过凝胶。

从而不同长度的分子在凝胶上形成不同的条带。

制备琼脂糖凝胶时，将适量琼脂糖粉末混入缓冲液中，加热使其溶解，然后将熔化的凝胶注入到有机玻璃板上，板四周用胶带封闭以防止渗漏。

在胶中插入梳子以形成加样孔。

待凝胶凝固后，将其置于缓冲液中进行电泳。

加样前，向DNA样品中加入一种或两种已知迁移率的染料，便于电泳过程中观察进度。

电泳完毕后，将凝胶浸泡于溴化乙锭溶液中使DNA 带显现，因为溴化乙锭可嵌入DNA分子碱基对间，并在紫外线照射下发出荧光。

第三步：Southern印迹由于琼脂糖凝胶易碎，不便于随后的分子杂交操作，所以需要将凝胶上的片段转移到尼龙膜上。

第四步：分子杂交杂交探针是一个被标记的DNA分子，其序列与我们希望检测的靶DNA互补，它们能形成碱基配对，因此能通过检测探针上的标记发出的信号来确定靶限制性片段在膜上的位置。

探针可以是合成的寡核苷酸或克隆的DNA片段。

为检测RFLP，探针通常是覆盖多态限制位点的克隆的DNA片段。

将膜置于含标记探针以及一些缓冲液的玻璃瓶中，将玻璃瓶缓慢旋转数小时以使探针有充分时间与其靶DNA杂交，洗膜以去除杂交的探针，然后检测信号。

探针通常是放射性标记的，信号通过放射性自显影（autoradiography）来检测。

放射性自显影图上看到的带是与探针互补的片段。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）DNA分子选定区域的指数级扩增。

反应时，将靶DNA分子与核苷酸、两条合成的寡核苷酸引物（primer）以及耐热DNA 聚合酶混合。

两条引物与待扩增区域的靶DNA两端复性，从而能够合成合适的寡核苷酸。

PCR可持续进行30～40个循环。

一个初始分子可以扩增出成千上万个相同的片段，相当于几微克。

因为它比Southern杂交分析更快速，现在更常用。

在DNA经限制性核酸内切酶处理之前，先将含RFLP的DNA区段扩增成多拷贝。

然后RFLP可通过用溴化乙锭对载有限制性片段的琼脂糖凝胶染色而看到。

1.2.2 简单序列长度多态性（SSLP）SSLP(simple sequence length polymorphism)是一系列不同长度的重复序列，不同的等位形式含有不同数目的重复单位。

与RFLP不同，由于每个SSLP可能有很多不同的长度变异体，所以它可以是多等位形式。

SSLP有两种类型：小卫星（minisatellite）：也称为可变数目的串联重复（variable number of tandem repeat,VNTR）。

重复单位长度为几十个核苷酸。

微卫星或简单串联重复（simple tandem repeat, STR）：它的重复单位长度短得多，通常为二、三或四核苷酸单位。

微卫星比小卫星更常用作DNA标记。

这有两个原因：第一，小卫星在基因组中并不是均匀分布，只是更常见于染色体末端。

用地理学术语来讲，相当于试图用灯塔图来找出一个岛中央得路一样。

而微卫星在基因组中的分布更便于用来定位。

第二，用于长度多态性分型的最快的方法是通过PCR，而PCR分型对于300bp以下的序列更快也更准确。

但大多数小卫星由于其重复单位相对较长，而且在一个序列中常有许多重复，因此长度大于300bp。

典型的微卫星含有10～30个长度不超过4bp的重复，因此它们更适合于PCR分型。

在人类基因组图上，已发现大约104个微卫星。

1.2.3 单核苷酸多态性（SNP）基因组中存在单个的点突变（point mutation），且数量极大，有些也可产生RFLP，但许多并不能，这是因为它们所处的序列不能被限制性内切核酸酶所识别。

在人类基因组中，据认为有200 000个以上的SNP(single nucleotide polymorphism)位于基因内，而可能有10倍于这个数字甚至更多的SNP位于非基因的DNA中。

SNP的优点是它的数目庞大，而且对SNP分型所用的方法不需凝胶电泳。

这非常重要，因为已证明凝胶电泳很难实现自动化，所以使用它的检测方法相对缓慢而且费力。

SNP以寡核苷酸杂交分析（oligonucleotide hybridization analysis）为基础，故其检测更快速。

寡核苷酸是在试管中合成的通常小于50个核苷酸的短单链DNA分子。

在适当的条件下，一个寡核苷酸与另一个DNA分子仅在可形成完全的碱基配对结构时才能杂交。

如果有一个错配，寡核苷酸上就有一个位置不能形成碱基对，则不能杂交。

因此寡核苷酸杂交能区分一个SNP的两个等位形式。

通过DNA芯片可以筛选到SNP。

DNA芯片DNA芯片是一块面积为2cm2或更小的硅片，以高密度排列方式携带有许多不同的寡核苷酸，芯片密度可以达到每平方厘米一百万个寡核苷酸探针，探针位于芯片表面，可以是合成的寡核苷酸或其它短DNA分子（如cDNA）。

待测DNA用荧光标记后加到芯片的表面，用荧光显微镜观察杂交情况，显示荧光信号的位置即表示该处的寡核苷酸与待测DNA发生了杂交。

2. 遗传作图的方法2.1 连锁分析遗传图谱是应用遗传学技术构建能显示基因以及其它序列特征在基因组上的位置的图。

遗传学技术包括杂交育种实验、人类家族的系谱分析。