茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化

第 39 卷 第 5 期 2011 年 5 月
东 北 林 业 大 学 学 报 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY
Vol． 39 No． 5 May 2011
茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化
李永艳 陈玉惠 敖新宇
（ 西南林业大学， 650224 ） 昆明，
表4 方差来源 A（ 蔗糖） B（ KNO3 ） C（ KH2 PO4 ） D（ MgSO4 ） 重寄生木霉 SS003 产毒条件正交试验方差分析结果 锈孢子死亡率 偏差平方和 自由度 443． 326 2 573． 509 439． 803 3． 388 2 2 2 F值 菌丝干质量 偏差平方和 1． 215 0． 122 × 10 － 4 1． 571 0． 010 × 10 － 4 1． 205 0． 014 × 10 － 4 0． 009 0． 003 × 10 － 4 F值 自由度 2 3． 288 * 2 0． 259 2 2 0． 385 0． 069
1
1． 1
材料与方法
供试材料 分离自茶藨生柱锈 供试菌株为重寄生木霉 SS003 菌株， ［7 ］ 菌锈孢子堆 ， 由西南林业大学提供。供试锈孢子于 2010 年 3 月中旬采自云南省昆明市东川区二二二林场的华山松疱锈
1 ） 西南林业大学重点基金项目 （ 110706 ） ； 云南省森林灾害预警 与控制重点实验室资助项目 （ ZK09A105 ） 。 1984 年 12 月生， 第一作者简介： 李永艳， 女， 西南林业大学保护 生物学学院， 硕士研究生。 通信 作 者： 陈 玉 惠， 西 南 林 业 大 学 基 础 部， 教 授。 E － mail： cyh196107@ 126． com。 收稿日期： 2010 年 10 月 22 日。 责任编辑： 程 红。
产毒培养基的筛选 SS003 在供试的 5 种培养基中均能生长和产毒 ， 但产毒 能力及生长量存在较大差异 （ 表 2 ） 。 相同培养时间内 （ 8 d） ， SS003 在 Richard 培养液中产毒最强， 其锈孢子死亡率（ 88． 75% ） 较对照（ 15． 00% ） 高 73． 75% ； Czapek 培养液中次之， 其锈孢 子死亡率（ 80． 00% ） 较对照 （ 20． 00% ） 高 60． 00% ； PSK 培养液 中最差， 锈孢子死亡率（ 35． 00% ） 仅比对照（ 5． 67% ） 高 29． 33% 。 5 种培养液中， PD 培养液最利于 SS003 菌丝生长， 8 d 后的菌 Richard 培养液次之 丝干质量每 100 mL 培养物达 0． 953 5 g， （ 菌丝干质量每 100 mL 培养物 0． 413 8 g） ， 而其余 3 种培养液 菌丝干质量每 100 mL 培养物均 均不利于 SS003 菌丝的生长， 5 种培养基中， Richard 和 PD 较适合 SS003 不足 0． 1 g。因此， Richard 培养基更适合产毒培 菌株的产毒和菌丝生长 。其中， 养， 而 PD 培养基则更适合菌丝生长 。
锈孢子对 SS003 产毒的影响： 在装有 100 mL 产毒最佳的 Richard 培养液的三角瓶里加入锈孢子 （ 5 g / L ） ， 连续振荡培 养 8 d 后制备毒素原液并进行生物测定和生物量测定 。 以未 加入锈孢子的毒素原液为对照 。每处理重复 3 次。
2
2． 1
结果与分析
注： * 表示 F 检验， 具有显著性差异。F0． 1 = 3． 110。F0． 05 = 4． 460。
Hale Waihona Puke 4 个因子影响 SS003 产毒的主次顺序为： B、 C、 A、 D， 最优组合 为 B2 C2 A3 D3 。由于该组合不在正交试验安排之列 ， 需对其验 证。验证结果表明， 该培养基组合的毒素原液对锈孢子的致 死率（ 75． 00% ） 高于正交表中任何培养基组合的毒素原液对 锈孢子的致死率。而 4 个营养因子对 SS003 生物量的影响由 C、 B、 D， 大到小为： A、 最优组合为 A3 C3 B1 D2 。
第5 期
李永艳等： 茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化
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ard） 和再减半试验（ 1 /4 Richard） 。以 Richard 培养液的毒素原 液为对照进行生物测定和生物量测定。每处理重复 3 次。
表1 水平 1 2 3 A（ 蔗糖） 20 30 50 正交试验因子水平 因 B（ KNO3 ） 5 10 15 子 C（ KH2 PO4 ） 2． 5 5． 0 7． 5 g·L － 1 D（ MgSO4 ） 2． 0 2． 5 3． 0
1）
摘 要 运用产毒培养基筛选、 锈孢子诱导和正交试验对茶 藨生柱锈重寄生木霉 SS003 菌株 （ Trichoderma atroviride） 的产毒营养条件进行优化 。结果表明， SS003 在 5 种产毒培养基中均能产毒和生长 ， 但 Richard 培养基更 PD 培养基则更适合菌丝生长 ； 茶 藨 生柱锈的锈孢子对产毒具有一定抑制作用 ； SS003 菌株的最佳 适合产毒培养， KNO3 10． 00 g / L、 KH2 PO4 5． 00 g / L、 MgSO4 3． 00 g / L 和 FeCl3 0． 02 g / L， 培养液中 产毒营养组合为： 蔗糖 50． 00 g / L、 各个营养元素的减量不利于毒素的产生 。 关键词 茶藨生柱锈菌； 重寄生木霉； 正交试验； 锈孢子； 毒素 分类号 Q939． 95 Optimal Conditions for Toxin Production of Mycoparasite Trichoderma atroviride on Cronartium ribicola / Li Yongyan，Chen Yuhui，Ao Xinyu（ School of Conservation Biology，Southwest Forestry University，Kunming 650224 ，P． R． China） / / Journal of Northeast Forestry University． － 2011 ， 39 （ 5 ） ． － 102 ～ 104 An experiment was conducted to optimize the nutritional conditions for toxin production of mycoparasite SS003 strain （ Trichoderma atroviride） on Cronartium ribicola J． C． Fischer by screening of culture medium for toxin production，aeciospore induction and orthogonal experiment． Results indicated that five kinds of culture media were suitable for toxin production and hyphal growth of SS003 ； however，the Richard liquid culture medium was most suitable for toxin production， and PD liquid culture medium was most suitable for hyphal growth． The aeciospores of C． ribicola had certain inhibitory effect on toxin production． The optimal nutritional combination for toxin production was obtained as sucrose 50． 0 g / L， KNO3 10． 0 g / L，KH2 PO4 5． 0 g / L，MgSO4 3． 0 g / L and FeCl3 0． 02 g / L． Reduction of each nutritive element in the culture solution was not favorable to toxin production． Keywords Cronartium ribicola； Trichoderma atroviride； Orthogonal experiment； Aeciospores； Toxin 五针松疱锈病是世界林木三大病害之一 ， 为国内外检疫 对象， 其病原为茶藨生柱锈菌 （ Cronartium ribicola J． C． Fischer） 。在我国主要危害红松（ Pinus koraiensis） 及华山松（ P． armandii） ［1］ 。据调查， 茶藨生柱锈菌目前已使云南上万公顷华 ［2 － 3 ］ ， 山松林发病 对长江防护林体系的建设和西部生态环境 的恢复造成了严重威胁 。茶藨生柱锈菌为长循环型转主寄生 锈菌， 具多型现象。在其生活史的 5 个阶段中， 锈孢子传播可 侵染转主寄主冰川茶藨子 （ Ribes glaciale wall． ） 、 滇中茶藨子 （ Ribes soulieanum Janczewski） 等［4］ ， 因此防治非常困难。长期 以来， 五针松疱锈病的防治主要以化学防治为主 ， 配以修枝、 铲除转寄主植物等营林技术措施 。这些方法虽然在一些重病 区取得一定防治效果， 但至今仍未能遏止住该病害的蔓延且 化学防治方法的长期应用还会带来严重的环境问题 。重寄生 木霉 SS003 菌株（ Trichoderma atroviride） 可导致茶藨生柱锈菌 ［5 － 6 ］ 。本 锈孢子迅速死亡， 而毒素是其致死的主要因素之一 研究针对该木霉产毒条件的优化进行研究 ， 以明确其毒素产 为毒素的基本性质研究及活性成 生所需要的最佳营养条件 ， 分的分离纯化和应用研究奠定基础 。 病的发病林分， 采集锈孢子器突破病部表皮且包被未完全破 裂时的锈孢子， 采集后的锈孢子于 4 ℃ 下低温干燥保存， 备 ［8 ］ Czapek 培养液［9］87 、 Richard 培养 用。对改良 Fries 培养液 、 ［9 ］77 、 PD 培养液、 PSK 培养液［10］5 种液体培养基进行筛选 。 液 1． 2 试验方法 然后 培养方法： 将供试菌株接于 PDA 培养基上扩繁 5 d， 用 Φ = 0． 6 cm 的打孔器在培养好的 SS003 平皿上打孔， 将打 好的菌块接种在装有 100 mL 培养液的 250 mL 三角瓶中， 每 L ∶ D = 12 ∶ 在 120 r / min 下振荡培养 （ 25 ℃ ， 瓶接种 3 块， 12 ） ， 培养液保持自然 pH 值。每处理重复 3 次。 毒素原液的制备： 将培养 8 d 的供试菌株培养物， 先用 8 4 000 r / min 离心 20 层纱布滤去菌丝体， 所得的滤液经 8 ℃ ， min， 上清夜即为毒素原液。 所有操作均在无菌条件下进行 。 滤液置于 4 ℃ 下保存， 备用。 生测方法： 生测采用凹玻片法， 即在灭过菌的凹玻片内注 入 100 μL 毒素原液后， 取少量锈孢子浸于其中 ， 适当搅拌使 盖上盖玻片后置于放有浸湿滤 锈孢子与培养滤液充分接触 ， 纸的培养皿内， 室温下 3 h 后观察锈孢子的变化情况 。 按照 ［7 ］ 杨艳红 的方法判断锈孢子的活力 。 生长量的测定： 把用 8 层纱布过滤好的菌丝放在已知质 量的定量滤纸上， 将滤纸连同菌丝体置于烘箱内 50 ℃ 烘至恒 质量。以菌丝干质量作为生长量的指标 。 产毒培养基的筛选： 将菌块分别接入 5 种培养液中， 连续 振荡培养 8 d 后制备毒素原液并进行生物测定和生物量测 定， 以未接入菌块的培养液为对照 。每处理重复 3 次。 产毒条件的优化： 以产毒培养基筛选所获最佳产毒培养 基（ Richard 培养液） 中的 4 个主要营养因子进行 4 因子 3 水 并以各组合的毒素原液进行生物测定 ， 同 平正交试验（ 表 1 ） ， 时测定生物量。每处理重复 3 次。 半培养基对 SS003 产毒的影响： 以正交试验筛选所获结 果对 Richard 培养液的各个营养因子的量进行减半 （ 1 /2 Rich-