DNA抽提
实验一-DNA提取
实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。
本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。
2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。
提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。
DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。
以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。
当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。
当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。
为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。
关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。
DNA抽提和质粒DNA制备
琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化， 琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用 酚抽提方法回收DNA
37
问题
从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖， 目的是（ ） A 抑制核酸酶
• B 保护DNA，防止断裂 C 加速蛋白质变性 D 有利于细胞破碎
38
用SDS-酚抽提DNA时，SDS浓度十分重要， 当SDS浓度为0.1%时，（ ）
1．菌株类型 2．质粒的大小 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制 4．细菌的培养与收集
65
（四）碱裂解法原理：
在 pHl2.0-12.6 碱 性 环 境 中 ， 线 性 的大分子量细菌染色体DNA变性， 而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然 状态。
66
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件 下，染色体DNA之间交联形成不溶性网 状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂 SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA 仍然为可溶状态。
上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅， DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约 80kb。
25
• 4 异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍 容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子 RNA（在异丙醇中可溶状态）。
• 5 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或 NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K 或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
31
DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
32
电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸 附带有负电荷的DNA分子。
在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳 至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。 但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
DNA的提取的原理和方法
DNA的提取的原理和方法DNA的提取的原理和方法一、实验原理DNA是生物体遗传信息的主要载体，它是一种长链的生物高分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶）按照特定的顺序排列组成。
DNA主要存在于细胞的细胞核中，也有一些存在于线粒体和叶绿体中。
DNA提取的原理主要是利用不同物质在特定溶剂中的溶解度不同，通过控制溶剂的种类和条件，将DNA从细胞中分离出来。
在DNA提取过程中，通常需要使用一些化学物质，如苯酚、氯仿等，来破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。
同时，还需要使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质，以便更好地分离DNA。
二、实验方法1.材料准备提取DNA的材料可以是动物组织、植物组织、微生物等。
不同的材料需要采用不同的处理方法，以最大限度地获得高质量的DNA。
例如，对于植物组织，可以使用液氮研磨法或CTAB法等方法进行提取。
2.细胞裂解细胞裂解是DNA提取的关键步骤之一，目的是破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。
常用的裂解方法有机械法、化学法和酶法。
机械法包括研磨、超声波等；化学法使用化学物质如苯酚、氯仿等；酶法使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质。
3.蛋白质去除在细胞裂解后，蛋白质也会随着DNA一起释放出来。
为了获得纯净的DNA，需要去除蛋白质。
常用的去除蛋白质的方法有苯酚/氯仿抽提法和盐析法。
苯酚/氯仿抽提法利用苯酚和氯仿的特性，将蛋白质和DNA分离开来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使蛋白质沉淀，而DNA则溶解在上清液中。
4.DNA沉淀去除蛋白质后，需要通过一定的方法将DNA沉淀下来。
常用的沉淀方法有乙醇沉淀法和盐析法。
乙醇沉淀法利用乙醇能够使DNA沉淀的特性，将DNA从溶液中分离出来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使DNA沉淀，然后通过离心等方法将DNA 收集起来。
5.DNA洗涤和溶解DNA沉淀后，需要用70%乙醇洗涤数次以去除杂质，然后用适量的TE缓冲液或去离子水溶解DNA。
TE缓冲液是一种常用的维持DNA稳定的缓冲溶液，含有Tris-HCl和EDTA二钠等成分。
提取dna的实验步骤原理
提取dna的实验步骤原理DNA提取是一项重要的实验技术，用于从细胞中分离纯净的DNA。
它在生物学、医学、犯罪学等领域具有广泛的应用。
DNA提取的过程可以分为以下几个步骤：样品收集、细胞破碎、蛋白质消化、DNA分离、洗涤、溶解和纯化。
首先，样品收集是DNA提取的第一步。
样品可以来自不同的来源，如血液、唾液、组织样本等。
对于血液样品，静脉采血是最常见的方式。
收集的血液样品需要采用抗凝剂进行预处理，以防止凝血。
细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一。
细胞破碎的目的是将细胞膜以及核膜破坏，释放细胞内的DNA。
常用的细胞破碎方法有物理破碎、化学破碎和酶解法。
物理破碎一般采用高速离心仪或超声波处理，通过机械力量破坏细胞结构。
化学破碎使用适当的溶液，如细胞裂解液（例如EDTA、SDS、蛋白酶K等）来分解膜脂质和蛋白质。
酶解法则通过酶的作用来降解膜和核酸。
蛋白质消化是为了去除提取过程中的蛋白质杂质。
蛋白质会干扰DNA的纯化和测定。
在蛋白质消化过程中，常用的方法是加入蛋白酶K或肾脏酸性蛋白酶等蛋白水解酶，通过其酶解作用将蛋白质降解。
DNA分离是将DNA与其他细胞组分分离的过程。
DNA在细胞破碎后呈现为线性或环状的形态。
为了分离DNA，一般采用盐溶液和有机溶剂共同作用的方案，如添加高浓度的盐类（如NaCl）和异丙醇。
这些溶剂会沉淀细胞残渣和蛋白质，而DNA则溶于水相中。
洗涤过程是为了去除残留的蛋白质和盐类。
洗涤液一般为酒精溶液，如酒精和醋酸盐。
洗涤时，将沉淀的DNA加入洗涤液中，通过离心使DNA沉淀，然后去除上清液。
此过程重复一至三次可以有效去除杂质。
溶解是将沉淀的DNA重新溶解于缓冲液中，以便于后续的操作。
溶解液可以是Tris-EDTA缓冲液、无菌纯水等。
在加入缓冲液后，将溶液置于水浴中进行搅拌和温度控制，使DNA彻底溶解。
纯化是最后一步，目的是去除DNA提取过程中的杂质，获得纯净的DNA。
常见的纯化方法有酚-氯仿抽提法和硅胶纯化法。
DNA提取
组织样DNA的提取方法：1．取黄豆大小组织样，用70%酒精棉球擦干净，尽量剪碎，置于2 ml离心管中。
（剪刀、镊子每次都擦干净）2．每管中加裂解液800ul，蛋白酶K 30ul。
3．55℃水裕14-20小时至管中无组织块为止（加封口膜防水）4．每管加等体积（800ul）饱和酚，摇匀器上摇出10-15分钟，10000转4℃离心10-15分钟5．取上清，置于另一管中，加500ul饱和酚，500ul氯仿（氯仿：异戊醇=24：1），混摇10-15分钟，10000转4℃离心10-15分钟6．取上清置于另一管中，加800ul氯仿，混摇10-15分钟，10000转4℃离心10-15分钟7．取上清，加800ul无水乙醇，室温混摇15-20分钟，10000转4℃离心7-8分钟8．倒掉管中液体（小心DNA 团块），再用70%乙醇轻洗，吸干乙醇，通风橱内风干加灭菌水溶解，4℃放置几个小时重要仪器、设备和试剂●UV-754型紫外线分光广度计●PCR扩增仪●DYYⅢ－12型电脑恒功率多功能电泳仪●TGL－16G高速台式离心机●DF110电子天平●HY-1型自动旋转式混匀仪●H-1微型混合器●蛋白酶K：MERCK公司产品●三羟基氨基甲烷（Tris）●十二烷基磺酸钠（SDS）●Tris饱和酚●琼脂糖●丙稀酰胺●N,N’-亚甲基双丙烯酰胺●TaqDNA聚合酶●4dNTP●PBR332 DNA/MSPI Markers: 华美生物工程公司●微卫星引物溶液配制(1) 10%十二烷基硫酸钠SDSSDS 10g溶于100 mL双蒸水中，30℃以上贮存。
(2) 组织样裂解液Tris.Cl（pH=8.0）50mM乙二胺四乙酸二钠（EDTA）100mM氯化钠（NaCl）100mMSDS 0.5%(3) 蛋白酶K：20mg/mL贮存液，-20℃保存(4) 1M Tris·Cl（pH 8.0，高压灭菌，NaOH调pH值）Tris 12.11g浓HCl 4.2ml加双蒸水定容至100ml(5) 0.5M EDTA（pH 8.0，高压灭菌，NaOH调pH值）EDTA 18.61g；加双蒸水定容至100ml(6) 1M NaCl（分装高压灭菌）NaCl0.5g；加双蒸水定容至50ml(7) 氯仿：异戊醇（24:1）氯仿480ml+异戊醇20ml(8) TE缓冲液（pH8.0）1M Tris.Cl 1 mL （Tris: 12.11g）0.5M EDTA 0.2 mL（EDTA: 18.61g）加蒸馏水定容至100ml（1） 10％SDS: SDS 10.0g溶于双蒸水中。
各种DNA提取方法
各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法一，基因组DNA提取方法制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。
2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。
根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。
试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/%SDS)混匀。
4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。
加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。
加入等体积的异丙醇。
室温10min。
2500rpm离心10min。
弃上清。
8、加入倍体积3mol/L乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。
-20℃20min。
9、12000r/min室温离心5min。
弃上清。
将DNA 溶于适量TE中。
二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm 离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80℃冻存。
酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿（Phenol-Chloroform）抽提DNA是一种常用的DNA 提取方法。
其原理是基于酚在酸性条件下具有与DNA高度亲和性的特点，可以将DNA从细胞溶液中抽提出来。
具体的步骤如下：
1. 细胞溶解：首先将待提取DNA的细胞样品加入适量的细胞裂解缓冲液中，通过机械或化学方法使细胞壁破裂，释放出细胞内的DNA。
2. 酚抽提：加入相同体积的酚溶液，并进行充分混合。
酚能与DNA形成复合物，并与其他细胞组分（如蛋白质和脂质）发生分层，形成一个DNA上层和一个下层。
3. 脱水：将抽提产物转移至新管中，加入酒精或异丙醇，通过离心将DNA沉淀下来。
脱水过程可以去除溶液中的多余酚，提高DNA沉淀的纯度。
4. 酯化：将DNA沉淀物溶解在适量的TE缓冲液（含有EDTA和Tris）中，经过一定的时间酯化，使DNA变得更为稳定。
5. 沉淀：通过低温离心将DNA沉淀下来，去除上清液。
6. 洗涤：用70%的乙醇洗涤并去除残余的盐、酚和脏物质。
洗涤过程中，可以多次进行离心和上清液倒掉操作。
7. 干燥：最后，将DNA输送液置于干燥器中或者自然风干，以去除溶剂中的残留物质，得到纯度较高的DNA。
通过酚氯仿抽提DNA的方法，可以从复杂的细胞中提取出高质量、高纯度的DNA，以供后续分子生物学研究使用。
基因组DNA抽提操作流程
基因组DNA抽提操作流程1.样本选择：选择适合抽提基因组DNA的样本类型，如细胞、组织或血液。
确保样本保存在合适的条件下，以保持DNA的完整性。
2.细胞破碎：对于细胞样本，首先需要将细胞破碎以释放DNA。
可以使用物理方法，如机械剪切或超声波处理，或者使用化学方法，如洗涤溶解和细胞裂解酶处理。
3.DNA溶解：将细胞裂解提取物加入DNA溶解缓冲液中，以彻底溶解DNA。
通常，添加蛋白酶K来去除蛋白质的干扰，增加DNA产量。
4.蛋白质去除：使用蛋白酶K等酶来去除样品中的蛋白质。
酶处理后，样品经过酚/氯仿萃取，即加入等体积的酚/氯仿混合物混合，离心分离水相和有机相。
DNA会在水相中，而蛋白质会在有机相中。
5.DNA沉淀：将水相中的DNA通过加入盐和冷乙醇来沉淀下来。
经过高速离心后，形成DNA沉淀，此时可以看到白色的DNA沉淀，即可将上清去掉。
6.DNA洗涤：将DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除盐、蛋白质和杂质。
洗涤过程中，可以使用离心将DNA沉淀到底，倒掉上清，重复洗涤2-3次。
7. DNA溶解：将洗涤后的DNA沉淀用TE缓冲液（含EDTA和Tris-HCl）等来溶解，使其在后续的分析和储存中稳定。
此时可以使用紫外可见光谱仪检测DNA的浓度和纯度。
8.DNA质量检测：可以通过琼脂糖凝胶电泳、分光光度计或荧光检测等方法对提取的DNA进行质量检测。
目的是确定DNA的完整性、浓度和纯度。
注意事项：-操作中严格遵守无菌操作，以防止DNA污染。
-样本处理前最好进行冰浴，以保持DNA稳定。
-减少DNA的损伤和降解，所有的操作和试剂都必须在冷冻或低温环境下进行。
- 防止RNase的污染，因为RNase会降解RNA，进而影响DNA的测定。
-严格按照实验操作要求进行步骤，以确保DNA提取的高纯度和高质量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验操作（1）：
鼠肝匀浆液 塑离 1/3匀浆液 匀浆液 白色絮状沉淀 +2.5V冰ETOH； 冰 ； 0.1MNaCl 颠倒混匀
+
20%SDS 25ul； ； EDTA 30ul； ； PK 20ul 50℃ ℃ 塑离 30min
&匀
+等体积酚：氯仿 等体积酚 等体积
保证高分子量DNA的完整性 的完整性 保证高分子量
影响因素： 影响因素： 物理因素：机械剪切力--牵拉DNA损伤， --牵拉DNA损伤 物理因素：机械剪切力--牵拉DNA损伤，对化学键破 DNA断裂 坏，DNA断裂 化学因素：过酸过碱----DNA变性 化学因素：过酸过碱----DNA变性 ----DNA 生物因素：DNA酶-------DNA DNA降解 生物因素：DNA酶-------DNA降解 操作注意事项： 操作注意事项： 物理因素：避免机械剪切力--钝口滴管， --钝口滴管 物理因素：避免机械剪切力--钝口滴管，动作轻柔 化学因素：防止过酸过碱----保证温和条件pH4 ----保证温和条件pH4～ 化学因素：防止过酸过碱----保证温和条件pH4～10 pH8.0） （pH8.0） 生物因素：抑制DNA -------低温 使用EDTA DNA酶 低温、 生物因素：抑制DNA酶-------低温、使用EDTA
四. DNA提取
酚抽提法 先用蛋白酶K SDS破碎细胞 消化蛋白， 破碎细胞， 先用蛋白酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白， 然后用酚和酚-氯仿抽提， 然后用酚和酚-氯仿抽提，最后乙醇沉淀 DNA大小为100－ 大小为100 获DNA大小为100－150kb
五、DNA的浓缩
乙醇沉淀： 乙醇沉淀：
（1）需要阳离子盐的存在 NaCl对含SDS样品好 对含SDS NaCl对含SDS样品好 （2）沉淀温度与时间 0℃，10－15分钟 0℃，10－15分钟 （3）离心 小于100bp DNA需超速离心 小于100bp DNA需超速离心: 4℃，12000g，10分钟 0－4℃，12000g，10分钟
二. 提取DNA的总原则：
1、保证核酸一级结构的完整性； 保证核酸一级结构的完整性； 2、排除其它分子的污染
a.样品不纯，失去抑制酶作用 样品不纯， 样品不纯 有机溶剂、高浓度的金属离子） （有机溶剂、高浓度的金属离子） b.蛋白质 糖/脂的污染降到最低 蛋白质/糖 脂的污染降到最低 蛋白质 c.DNA中无 中无RNA 中无
短期贮存： 1. 短期贮存： 4℃或 20℃存放于TE（tris和EDTA，pH8） 存放于TE 4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA，pH8） 缓冲液中 2. 长期贮存： 长期贮存： 70％乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿， DNA溶液中加一滴氯仿 在70％乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿， 70℃保存 -70℃保存
DNA浓度（μg/ml） DNA浓度（μg/ml） 浓度 1/光径 = A260nm ×50 ×稀释倍数 ×1/光径
DNA的吸收 DNA的吸收 峰在260nm 峰在260nm OD相当于 相当于: 1 OD相当于: 50 μg/ml DNA 40 μg/ml RNA 20 μg/ml 寡核苷酸
八. DNA的贮存
六. DNA的鉴定
分光光度法
在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收， 260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收， 处测定DNA溶液的光吸收 之比应在1.75 1.75－ A260与A280之比应在1.75－1.80 低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚 高于此值表明有RNA RNA的残留量 高于此值表明有RNA的残留量
DNA纯度鉴定： DNA纯度鉴定： 纯度鉴定
A260/A280 ≈ 1.8 《 1.8 》 1.8 纯 酚或蛋白质污染 RNA污染 RNA污染
七. DNA的定量
分光光度法： 分光光度法：
测定DNA在 的光吸收， 测定DNA在A260nm的光吸收，计算浓度 DNA A260×稀释倍数×50＝ 稀释倍数×50＝ µg/ml (双链DNA) (双链DNA) 双链
+70% ETOH洗 洗
10000rpm，5min ，
轻缓混匀 10000rpm，5min ， 沉淀+1mlTE溶解 溶解 沉淀 水相 37℃ ℃ 水相 刻离 +RNase20ul 30min 刻离 +2.5V冰ETOH； 冰 ； 0.1MNaCl
白色絮状沉淀
Precipitated DNA molecules appear as long pieces of fluffy, stringy, web-like strands.
保证高分子量DNA的纯度 的纯度 保证高分子量
使用方法：SDSK使用方法：SDS-Proteinase K-EDTA SDS：十二烷基磺酸纳（硫酸纳）------离子型表面活性剂 （1）SDS：十二烷基磺酸纳（硫酸纳）------离子型表面活性剂 主要功能：1.溶解细胞膜上的脂质与蛋白质 溶解细胞膜上的脂质与蛋白质， 主要功能：1.溶解细胞膜上的脂质与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏 细胞膜 2.解聚细胞中的核蛋白 将组氨酸从组蛋白上拆下来， 解聚细胞中的核蛋白： 2.解聚细胞中的核蛋白：将组氨酸从组蛋白上拆下来，打 开二硫键 3.SDS能与蛋白质结合成为 能与蛋白质结合成为R SO3----R+-Pro的复合物 ----R+ 的复合物， 3.SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3----R+-Pro的复合物， 是蛋白质并行而沉淀下来 4.SDS能抑制RNase的作用 在以后的提取过程中， 能抑制RNase的作用， 4.SDS能抑制RNase的作用，在以后的提取过程中，必须把 他去除干净 蛋白酶K （2）蛋白酶K： 主要功能：1.蛋白水解酶活性----广谱蛋白酶 蛋白水解酶活性----广谱蛋白酶， SDS、EDTA存在下保 主要功能：1.蛋白水解酶活性----广谱蛋白酶，在SDS、EDTA存在下保 持很高的活性 2.将蛋白质降解成肽或小片段的氨基酸 2.将蛋白质降解成肽或小片段的氨基酸 EDTA： （3）EDTA：乙二胺四乙酸 主要功能：金属离子的弱螯合剂，抑制DNase DNase的活性 主要功能：金属离子的弱螯合剂，抑制DNase的活性
操作注意事项
1.为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须： (1) 匀浆时应保持低温 冰浴中 匀浆时应保持低温(冰浴中 冰浴中)，匀浆时间应短(30s／次，2次 ，勿用玻璃匀浆器 (2) 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成 钝口 (3) 苯酚 苯酚-氯仿抽提时勿剧烈振摇 勿剧烈振摇 2.保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性 3.苯酚 苯酚是一种强烈的蛋白变性剂。实验时，应戴手套操作 应戴手套操作，避 苯酚 应戴手套操作 免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注 意将盛苯酚的试剂瓶盖好 苯酚的试剂瓶盖好（防氧化-8-羟喹啉） 苯酚的试剂瓶盖好 4.移液枪的使用
第一章 基因组DNA分析 基因组DNA DNA分析
实验一 高分子量DNA的提取和纯化 高分子量DNA DNA的提取和纯化
一、原理
DNA是染色体的组成成分，遗传的物质基础 研究遗传、疾病发生的基础 研究的前提：DNA的提取
1、破细胞----SDS破坏细胞壁 、破细胞 破坏细胞壁 2、去蛋白 苯酚（蛋白变性剂） 苯酚（ 、去蛋白----苯酚 蛋白变性剂） 3、除RNA----RNAase 、
原理： 原理： 用蛋白酶K SDS在EDTA存在的条件下 存在的条件下， 用蛋白酶K及SDS在EDTA存在的条件下， 裂解细胞、消化蛋白质，使核蛋白解聚、 裂解细胞、消化蛋白质，使核蛋白解聚、细 胞内存在的DNA酶失活， DNA酶失活 胞内存在的DNA酶失活，酚-氯仿有机溶剂多 次抽提以后， 次抽提以后，用透析或乙醇沉淀得到纯化的 DNA
实验操作（2）：
白色絮状沉淀
+70% ETOH洗 洗 余原液 沉淀加0.3-0.5ml 沉淀加 TE溶解 溶解 比色定量 PCR
稀释成3ml（1：30）， ），OD260/OD280比色 取100ul稀释成 稀释成 （ ： ）， 比色
定性、 定性、定量
三. DNA样品准备
生物组织： 生物组织：
最好新鲜组织，若不能马上提取， 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 －70℃或液氮 ℃ 液氮冷冻敲碎研磨 组织匀浆法 液氮匀浆法
1. 二取一 DNA抽提注意事项 抽提注意事项（ 物及生） DNA抽提注意事项（化、物及生） blot的流程 Southern blot的流程 2. 五取二 核酸探针 分子杂交 限制性内切酶 预杂交 随机引物标记