实验九、等电聚焦电泳
等电聚焦电泳(最新)
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11
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重 复性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经 分离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的 区带
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（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
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㈡引入电场时的变化
载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最 快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置 时才停止。
其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其 次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电 荷被减少到零才停止。
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pH
ApH=pH’
+
b
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-
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当环境pI<pH’时，它带正电荷，朝 负极移动，直至移动到它的等点电处， 在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI 处具有一定的缓冲能力，因此在它附近 形成一个pH稳定区域。（图c）
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pH
pH=pH’ A+
载体两性电解质是一系列不同分 子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个 连续的pH梯度。
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pH梯度形成的过程
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㈠没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
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等电聚焦技术的基本原理
等电聚焦技术的基本原理等电聚焦技术是一种用于分离和纯化蛋白质或其他生物分子的技术。
本文将详细介绍等电聚焦技术的基本原理，主要包含以下几个方面：等电点、pH梯度、电泳、温度和缓冲液。
1.等电点等电点是指蛋白质等电点，即在溶液中同时存在正负电荷，且正负电荷量相等时的pH值。
蛋白质分子在等电点时呈电中性，最容易分离。
这是因为蛋白质分子在等电点时，正负电荷相互抵消，蛋白质分子不再带电，因此不容易再与其他分子相互作用，从而更容易被分离。
2.pH梯度在等电聚焦技术中，pH梯度是指溶液中不同部位的pH值不同，通常是在一个范围内变化。
通过控制pH梯度的变化，可以使得蛋白质分子在电场中的迁移率不同，进而使得不同的蛋白质分子得以分离。
pH梯度的建立可以通过使用缓冲液和调节溶液的酸碱度来实现。
3.电泳电泳是指带电粒子在电场中的移动现象。
在等电聚焦技术中，电泳主要是用于分离不同的蛋白质分子。
在电场作用下，带电的蛋白质分子会向相反电荷的电极移动，移动速度与蛋白质分子的电荷量、分子量和溶液的pH值等因素有关。
通过控制电场强度和电泳时间，可以进一步优化蛋白质分子的分离效果。
4.温度温度会影响蛋白质分子的状态和形状，进而影响其分离效果。
在等电聚焦技术中，温度主要通过影响水的体积来实现对蛋白质分离效果的影响。
温度升高会导致溶液的粘度降低，从而使得蛋白质分子的移动速度加快，有利于提高分离效率。
但是，过高的温度会导致蛋白质分子变性，影响其结构和功能，因此需要控制适宜的温度范围。
5.缓冲液缓冲液是指能够抵抗外来酸碱物质并保持其pH值稳定的液体。
在等电聚焦技术中，缓冲液的作用是保护蛋白质分子，使得其能够在电场中保持稳定的形态和结构。
常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。
缓冲液的选择应该根据具体实验条件和分离的蛋白质分子特性进行优化。
总之，等电聚焦技术是一种基于电荷和pH值分离蛋白质分子的有效方法。
通过掌握等电点、pH梯度、电泳、温度和缓冲液等基本原理，可以实现对蛋白质分子的高效分离和纯化。
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
等电聚焦电泳
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端 c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH逐渐增加的 直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
进行IEFE必须具备3个条件：
3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEFE作为第一相
参考书目
办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位 置而给出一个pI梯度。
电解槽中，通电后，正负两极都会发生电
极反应：
正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
在负极引起pH值的升高，在正极pH 下降，另外在电极槽的正极端放的是酸 性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了 在电极附近pH的急剧变化。（图a）
pH
pH=pH’
A+
+
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电
解质也会各自迁移到它们的等电点处， 由于它们的数量足够多，各自的等电点 相差很小，从而形成一个pH梯度。（图 d）
pH
+
-
d
假设在一个系统中含有极多的有 适当的等电点和它的等电点处有一 定的缓冲能力的两性电解质，因此 形成的pH梯度将是连续平滑的。
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
等电聚焦ief电泳技术
等电聚焦[IEF]电泳技术等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
⒈IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH 值逐渐增大。
如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。
同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
⒉pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。
另一种是天然pH梯度。
天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。
电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。
电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。
由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。
pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度，如图16-3所示。
等电聚焦电泳
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载体介质
载体介质
理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定的电流通 过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小，易于应用 分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开，而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。
基本原理
基本原理
在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两 性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移 动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极 移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白 质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置 上，形成分离的蛋白质区带。
pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他 们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。
凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。
技术特点
技术特点
①分辨率高，可将等电点相差0.01～0.02 pH单位的蛋白质分开；②灵敏度高，可以分离浓度很低的样品， 且重复性好；③随电泳时间的延长，区带越来越窄；④样品混合液可以加在电泳系统的任何部位，通过等电聚焦 作用，各组分均能聚焦到各自等电点的pH位置；⑤可以准确测定多肽、蛋白质等两性电解质的等电点。
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳
电聚焦电泳（Electrophoretic Focusing，EF）是一种用于实现
高灵敏度、高精度分子体系和复杂生物分子分离分析的分子生物技术。
它把目标分子样品流经电泳液体，有效地将它们隔离到不同的位置，
这样就可以根据它们的大小、结构以及分子量等不同而被分开。
相比
具有选择性分离力的磁聚焦，EF分离的结果更快、更准确，可以易于
扩展和实现，并且对于体积小的细胞样品具有较强的灵敏度。
电聚焦电泳的原理是根据移动的电势差分离电荷相同的分子。
当
电荷相同的分子分离时，电荷混合物会电离，电脉冲时会产生一层聚
焦薄膜，把目标分子固定在内部，从而形成一个特定的分子群。
同时，该分子群会以均匀的速度实现空间上的分离。
电聚焦电泳的应用非常广泛，可以用于检测RNA、DNA、蛋白质、小分子微粒及细胞分子。
电聚焦电泳还能用于测定电荷的究竟引起什
么样的分布；测定环境中电荷的分布及分离度；克隆和检测RNA、DNA、蛋白质及小分子微粒等。
同时，电离力学也能够测量空气微粒中非饱
和状态的水汽分布状况以及其对应的稳定性能等。
电聚焦电泳的灵敏度可以加强样品的分离和分析效果。
近年来，
众多研究人员利用电聚焦电泳进行精确的分析和实验，从而推动该技
术的发展。
电聚焦电泳的应用不仅仅可以操作小分子，也可以为更大
分子的实验提供便利。
随着电聚焦电泳在实验领域的不断发展，它在
生物分子分离与分析方面将有着广泛的应用。
实验九、等电聚焦电泳讲解材料
四、操作方法
1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易 聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)
（2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
(2) 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以 及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250 染色，加样量可为50-150 g；如用银染色， 加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30 l。
六、思考题
(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。
(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意 事项有哪些？
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极 液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器 长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管， 推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁 与凝胶分开，凝胶条即可流出。
4 .固定染色
取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固 定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h， 用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰， 量出蛋白带距正极端的距离。
实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 电泳测定蛋白质的等电点
一、目的要求
1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白Байду номын сангаас的等
电点方法
二、原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其 中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两 性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极 到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作 用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH 值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区 带。
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六、思考题
(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。
(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意 事项有哪些？
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极 液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器 长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管， 推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁 与凝胶分开，凝胶条即可流出。
4 .固定染色
取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固 定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h， 用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰， 量出蛋白带距正极端的距离。
实验九、等电聚焦电泳
两性电解质载体(carrieFra bibliotek ampholytes)
(1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳 定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变 pH梯度。
(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保 持均匀的电场。
(3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与 生物大分子分开。
器材：圆盘电泳槽 、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床
四、操作方法
1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易 聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)
（2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
0.1
蒸馏水
6.75
混匀后置真空干燥器中抽气10 min
10%过硫酸铵
0.05
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定 到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔 密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢 氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽 接负极，打开电源，先调电压至100 V，待电压稳定后再升 到300 V，电泳2 h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电 源。
固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度后， 直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。
五、注意事项
(1) 盐离子可干扰pH梯度形成并使区带扭曲。为 防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透 析或用SephadexG-25脱盐，也可将样品溶解 在水或低盐缓冲液中使其充分溶解，以免不溶 小颗粒引起拖尾。
5. pH梯度的制作
取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每 隔0.5 cm切下一段，依次放入已编好号并装有1 mL蒸馏水的 试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH 值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度 曲线。
6 .蛋白质样品等电点的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无 变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI
图3.6聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7
(2)浓缩胶pH6.7
(3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
三、试剂与器材
试剂：两性电解质载体pH 3-10 、10%四甲基乙二胺 、 10%过硫酸铵 、5%H3PO4 、2%NaOH 、40%蔗糖 、 0.04％考马斯亮兰R250 、7%醋酸