等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定
等电聚焦电泳的两种方法
等电聚焦电泳的两种方法等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。
等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。
本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。
经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。
关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。
它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。
[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。
[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。
[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。
现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。
我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。
目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。
[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。
凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。
该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。
IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。
样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。
当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。
这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。
IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
实验九、等电聚焦电泳讲解材料
四、操作方法
1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易 聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖)
（2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
(2) 加样量则取决于样品中蛋白质的种类、数目以 及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R-250 染色，加样量可为50-150 g；如用银染色， 加样量可减少到1 g。一般样品浓度以0.5-3 mg/mL为宜，最适当加样体积为10-30 l。
六、思考题
(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。
(2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意 事项有哪些？
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水充分洗净两端电极 液，在凝胶条的正极端插一铜丝为标记。用灌满水的注射器 长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管， 推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁 与凝胶分开，凝胶条即可流出。
4 .固定染色
取其中一条凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固 定前的凝胶条长度。放入染色液中同时进行固定染色1-2 h， 用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰， 量出蛋白带距正极端的距离。
实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 电泳测定蛋白质的等电点
一、目的要求
1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白Байду номын сангаас的等
电点方法
二、原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其 中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两 性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极 到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作 用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH 值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区 带。
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳等电聚焦电泳（dielectrophoreticfocusing）是一种用于细胞、分子、纳米颗粒和其他微流体的微流控技术，通过利用非线性电势场的电力作用力而形成。
等电聚焦电泳被广泛应用于医学、生物、农业等领域，用于扩大细胞、分子的空间分布，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离等。
等电聚焦电泳技术是借助电力作用力而产生的，它可以控制和操纵介观尺寸细胞及其他形态、性质及体积的微流体，并将它们集中在一定的位置上，使得它们可以形成一个固定的浓度差，从而有效地改变细胞组织或分子组织。
此外，等电聚焦电泳可以将细胞和分子单独分离，用于研究其功能、形态和特性，对细胞组织的分离比传统的手工分离有更高的灵活性和精确度。
等电聚焦电泳技术主要包括三个关键步骤：电场的制备，细胞或分子组织的悬浮和集中以及离心纯化等步骤。
首先，电场的制备涉及制造一个稳定的电场，也就是控制静电场的强度，以及形成旋转电场的大小及方向，以使细胞或分子组织能够在最佳的条件下在电场中运动。
其次，通过几种方法将细胞或分子组织悬浮在溶液中，并且在电场中形成一定的浓度差。
最后，采用离心力来调节浓度差，以集中细胞或分子组织。
等电聚焦电泳技术有许多优势可以利用，其中最大的优势是可以在低成本、高效率和高精确度的情况下分离细胞、分子和纳米颗粒。
等电聚焦电泳技术也具有较强的灵活性，可以根据实验需求设计合适的电场，以实现一些特殊的功能要求，例如分离染色体、调整细胞的形态和性质、对微流体进行排序，并且可以在体外环境实现实验工作，不会受到体内环境的限制。
等电聚焦电泳技术是一种重要的技术，它可以确保细胞、分子和纳米颗粒的有效分离，有助于研究各种特定类型的细胞及其功能，也可以用于分离细胞组织或分子组织，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离。
随着技术的进步和发展，等电聚焦电泳技术的应用也会越来越广泛，在不久的将来会得到更多的应用，有助于推动科学和技术的发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。
等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。
本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。
经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。
关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。
它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。
[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。
[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。
[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。
现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。
我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。
目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。
[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。
凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。
已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用1%或2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。
[2][4][5][6]在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。
欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。
虽然已有文献报道，将牛血浆稀释10倍后，用2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原[7]，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。
随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。
等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。
它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与SDS-PAGE组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。
因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。
根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为37 kDa，由两条多肽链通过一个二硫键相连，A链为5kD，B链为32kD。
[2]这样就可以在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从IEF中得知其等电点。
等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。
2.等电聚焦基本原理1本课题得到学校“211工程”基金资助。
等电聚焦(Isoelectrofocusing, IEF)是1966年由瑞典科学家Harry Rilbe和Olov Vesterbery 建立的一种高分辨的蛋白质分离分析技术。
它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的不同在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离分析。
蛋白质是由不同数量和比例的L-α氨基酸组成的。
氨基酸侧链在不同的pH环境中带不同的电荷。
当pH>pI时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移动；当pH<pI时，蛋白质带正电荷，在电场的作用下向负极移动；当pH=pI时，蛋白质所带的净电荷为零，在电场的作用下不发生移动。
蛋白质的等电点范围很宽，因此可以依据等电点来进行蛋白质的分离和分析。
在凝胶中放入载体两性电解质，通以直流电后即可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度。
当带电的蛋白质分子进入此体系时即移动并聚焦于相当其等电点pH的位置。
因此，本技术可依据等电点的不同将蛋白质分子分离，并且反之根据蛋白带pH在梯度中的位置测得该蛋白质的等电点。
构成凝胶介质pH梯度的载体两性电解质是由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构物和同系物组成的。
载体两性电解质在凝胶中形成pH梯度的时间约为30分钟到1小时。
当蛋白质在电场中迁移到它的等电点位置时，本身没有净电荷，电场不能使其移动。
如有扩散，带有载体两性电解质的凝胶介质会使其荷电，阳、阴极则将重新吸引它回到等电点位置，因此蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带。
这种“浓缩”或称“聚焦”效应使等电聚焦的分辨率大大高于常规电泳，是一向电泳中分辨率最高的电泳技术。
3.材料和方法3.1实验用品3.1.1样品及其处理胰蛋白酶（华美生物工程公司）、牛凝血酶（美国sigma分装，24.5U/mg，1000U）。
称取胰蛋白酶20mg，用重蒸水定容至10ml，制备成2mg/mL的胰蛋白酶样品。
根据牛凝血酶的比活力和分装的活力单位计算，可知酶的含量约为40mg，用20ml重蒸水将其溶解为2mg/ml的样品，分装成20份，于-20℃保存。
胰蛋白酶和牛凝血酶的溶解性都很好，溶解样品时无需再加入助溶剂。
3.1.2标准品及其处理等电点标准（英国Amersham Biosciences，pH3-10，235µg/vial），低分子量蛋白标准（英国Amersham Biosciences，分子量14.4kDa~97kDa，575µg/vial；中科院上海生化所，分子量14.4kDa~97.4kDa，40µg/种蛋白质）。
用100µL重蒸水溶解等电点标准，分装成10份，于-20℃保存，每次的上样量为10µL （3.25mg/ml）。
低分子量蛋白标准按使用说明书中的方法处理，分装后保存于-20℃。
3.1.3试剂乙醇（95%）、甲醇、冰醋酸、盐酸（6mol/L）、磷酸（1mol/L）、氢氧化钠（0.5mol/L，1mol/L）、磺基水杨酸、三氯乙酸、甘油、巯基乙醇。
（以上试剂除三氯乙酸为CP级、巯基乙醇为香港生产外，其它均系国产AR级。
）丙烯酰胺（美国sigma分装，电泳级，纯度：>99%）、甲叉双丙烯酰胺（瑞士Fluka）、过硫酸铵（华美生物工程公司）、TEMED（中科院上海生化所东风生化技术公司）、载体两性电解质（pH3~9.5，进口分装；pH5~7，北京科百奥生物科技有限公司）、考马斯亮蓝R250（瑞士Fluka分装）、甘氨酸（产地：上海，纯度：>99%），Tris Base（Promega Corporation）、SDS（sigma分装）、琼脂糖（华美生物工程公司）、溴酚蓝（北京化工厂）。
欲将干胶制作在玻璃板上，还要用到亲和硅烷和剥离硅烷。
3.1.4主要仪器和设备DYY-12C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、DYCP-36型等电聚焦电泳槽（北京市六一仪器厂）、DYCZ-24D迷你垂直型电泳槽（北京市六一仪器厂）、层析实验冷柜（或恒温循环器）、酸度离子计（pH211）、脱色摇床、电子称、恒温培养箱、移液器。
3.1.5溶液的配制30%①凝胶单体贮液：等电聚焦电泳用C=3%的单体贮液：丙烯酰胺14.55g，甲叉双丙烯酰胺0.45g，重蒸水溶解，定容至50ml（4℃棕色瓶中，可保存两周）。
SDS-PAGE用C=2.6%的单体贮液：丙烯酰胺14.61g，甲叉双丙烯酰胺0.39g，重蒸水溶解，定容至50ml（4℃棕色瓶中，可保存两周）。
10%②SDS贮液：2.5gSDS溶于25ml重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。
20%③SDS贮液：5.0gSDS溶于25ml重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。
④电极液：pH3～9.5等电聚焦电泳电极液：阳极1mol/L H3PO4；阴极1mol/L NaOH。
pH5～7等电聚焦电极液：阳极0.5mol/L冰醋酸；阴极0.5mol/L NaOH。
SDS-PAGE电极液：每次用量以500ml计算，称取Tris Base 1.514g，甘氨酸7.207g，10%SDS贮液5ml,定容至500ml（pH 8.3，不用调pH值）。
SDS⑤-PAGE分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取Tris Base 18.171g，用6 mol/L 盐酸调pH值至8.9后，用重蒸水定容至100ml（4℃保存）。
SDS⑥-PAGE浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取Tris Base 12.114g，用6 mol/L 盐酸调pH值至6.8后，用重蒸水定容至100ml（4℃保存）。
SDS⑦-PAGE上样缓冲液：称取SDS 1g，甘油5ml，巯基乙醇2.5ml，溴酚蓝2滴，浓缩胶缓冲液25ml，用重蒸水定容至50ml（4℃保存）。
⑧平衡液：巯基乙醇5ml，浓缩胶缓冲液6.25ml，20%SDS贮液11.5ml，甘油10ml，定容至100ml。
⑨固定液：35%甲醇（V/V），10%三氯乙酸（W/V），3.5%磺基水杨酸（W/V）。
⑩染色液：35%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V），0.1%考马斯亮蓝R250（W/V），溶解后用滤纸过滤备用。
○11脱色液：25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。
○12保存液：10%甘油（V/V），25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。
○1310%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶解于1ml重蒸水中，现用现配。
3.2方法和步骤通过3.0～9.5pH梯度胰蛋白酶等电点的测定，建立等电聚焦电泳的方法。
利用已建立的方法，经3.0～9.5pH梯度的测定，牛凝血酶等电点的范围在5～7，然后在5～7pH梯度的范围准确测定牛凝血酶的等电点。
因本实验中经5～7pH梯度的范围等电聚焦电泳后，牛凝血酶产生了13条带，故采用了双向电泳的方法（第二向：SDS-PAGE），从而以牛凝血酶相对分子质量为依据确定其条带和等电点。
3.2.1等电聚焦凝胶的配制和灌胶①凝胶的配制：按照表1-1的比例配制凝胶。
本实验采用T=5%的凝胶，每次灌胶时配制10ml 即可。
表1-1 等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶的配制溶液成分体积30%凝胶贮液/ml 1.7重蒸水/ml 7.675两性电解质/ml 0.625TEMED/µL 10 10%过硫酸铵/µL 25表1-2 SDS-PAGE凝胶的配制溶液成分分离胶浓缩胶T值7.5% 5% 30%凝胶贮液/ml 2.5 0.83 重蒸水/ml 4.8 3.4 分离胶缓冲液/ml 2.5 —浓缩胶缓冲液/ml—0.6310%SDS/µL 100 50 TEMED/µL 50 25 10%过硫酸铵/µL50 25 总体积/ml 10 5②灌胶：将玻璃板洗净晾干。