第一向等电聚焦系统
2014-双向电泳(王)
增加样品溶解性的手段
• 变性剂：尿素和硫脲
– 通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏 水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域
• 表面活性剂：非离子和两性离子去污剂
– 经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至 少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂 非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂 CHAPS和SB3-10等
蛋白质组实验室流程
双向电泳
2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千 种蛋白质的技术 。
第一向—等点聚焦(IEF)
– pH梯度载体 – pI
第二向—十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)
– SDS作为变性剂和助溶剂 – 分子量
双向电泳的基本原理与流程示意
两性电解质
聚丙烯酰胺
– Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的 少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用 时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。 浓度过高会使IEF的速度降低。
– 另外，为了保证实验的精确性，在选择不同 pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的 pH值与之相符合。
九楼蛋白质组平台
第一向 等电聚焦电泳仪
两维间的平衡
• 一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑 料膜间于－80°保存数月。
• 但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分 离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE顺 利进行。
• 建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、 6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液 先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的 上述缓冲液平衡15min。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
技术参数及功能要求
3.7.3输出功率：100W
3.7.4输出类型：恒电压,恒电流或恒功率，并自动切换。
3.7.5储存和调用最多3个方法
3.7.6输出终端：并行两套
3.7.7计时器：1min-500h, 1Vh-500kVh,连续可调
3.7.8安全特性：超载/短路监测
3.8冷却水循环装置：MultiTemp IV
3.13创建合成凝胶图像，取多块胶上点的位置，形状和强度的平均值
3.14表格形式的蛋白点，匹配点群，凝胶，实验组等多重报告方式，一次可以进行多重选择
3.15给出匹配点群，实验组的带有误差标记的柱状图
3.16可以进行网上检索，蛋白点链接到联合数据库，链接到ExPASy®和SwissProt®数据库
3.17以XML格式输入输出数据
3.8.3输出、存储和打印专业的报告
3.8.4通过网络远程监控仪器
3.9水平调节：可调节水平的支脚
3.10硬透明、软遮蔽兼具设计，无需更换上盖，操作更随意适合运行对光敏感的蛋白标记样品，并有开盖自动断电的高压保护装置
3.11电源：内置电源
3.11.1电压：0-10000V,分辨率:10V
*3.11.2电流：0-150µA,分辨率：1µA
3.3通用检测光源：高能闪烁氙灯，使用寿命>108次闪烁；
3.4硬件设计：模块化设计，功能模块任意组合；
3.5 *检测器：光吸收（紫外硅光电二级管）、荧光（扩展波长低暗电流PMT）、发光（低暗电流单光子计数PMT）
3.6温控：室温以上5℃到42℃；
3.7振荡器：线性和轨道振荡，振幅和时间可调；
3.8第三方认证：Transcreener Red FI；Transcreener Far-red FP；Transcreener Red TR-FRET；HTRF ；DLReady
蛋白质组学研究中双向电泳技术的应用
胶中或膜上切取这些 目标蛋 白质作鉴定。现在绝 大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成 的。
丙烯 酰胺 共 价聚 合而 成 ＩＧ胶 条 ，其 优势 主要 Ｐ 有 ［ ：ｐ ６ Ｈ梯度稳定 ，聚焦准确 ，精度高 ，梯度分 ］ 辨率可 达 ００ １Ｈ ． ｐ ；无 阴极漂移及碱性蛋 白丢失 ０
在主要和通用的一向等电聚焦方式［ 。 引
２ ３ 第二 向 电泳 ．
寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 （ ￣ ｔｓ ｘｔ
—
ｔｍｌ—ｔｎｌｍ ｄ ｅ ｒｓ ｌ ）的方 法 ｏ ｒ ａ ｉ ａｙ ｏｉ ｄｆｍ ，ｅ＇ ａ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｍｓ
第二向是十二烷基磺酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶
泳 ，进 行染 色 。 目前 实 验 室 最 常用 的显 色 方 法 是
第一向是等点聚焦电泳 ，根据一 向等 电聚焦
方 式 的不 同 ，可 将 双 向 电泳 分 为 ３种 系统 ： （ ） １
ＩＯ—Ｄ Ｌ （ｓ Ｓ ＡＴ ｉ ｏ—ｅ ｃ ｉ ｆ ｕｉ ｆｌ ｅ 锄 ・ ｌ ｔｃ ｏ ｓ ｇ ｌｗ ｄ ｂ ｅ ｒ ｃ ｎ ｏｏ ｔ ｎ ｉ ｒｓｅｔｍｏ ｕａｎｓ ｘｒ ｓｄ ａ ｏｓ 系 ｉ ｗｔ ｅｐｃｔ ｌ ｌ ａｓｅｐｅ ｅｉ ｄｌ ｎ ） ｏ ｈ ｏ ｅ ｎ ｃ ｓ ｎ ｔ
（ｎ ｎ — ｅ ｕ ｉｒ ｍ ｐ ｇａｉ ｔ ｅ ｃ ｏｈｒｓ ， ｏ ｑ ｉｂｉ ｌ ｕ Ｈ ｒ ｅ ｌ ｔｐｏ ｉ ｄｎ ｅｒ ｅｓ
Ｎ Ｐ Ｇ ）系 统 ，主 要 用 于 分 离 碱 性 蛋 白质 ，但 ＥＨ Ｅ 如果 聚焦 达到 平 衡 状 态 ，碱 性 蛋 白会 离 开 凝胶 基
概 念 出现之前 ，免 疫印迹 法就 已得 到广 泛 的应 用 。
方法与生物质谱技术 的不断进步，以及两者有效 的结合 ，使研究人员能够更加有效地分离蛋 白质
Hoefer 双向电泳使用说明(Hoefer)
第一部分介绍1.0手册的介绍这本手册分五大部分。
第一部分对手册进行了介绍。
第二部分介绍了样品预处理的方法。
第三部分细叙了进行双向电泳第一向电泳的过程。
第四部分介绍了利用IPG胶条进行第二向电泳的一般方法。
第五部分讨论了双向电泳的显影和结果分析。
在这里，使用Amersham pharmacia Bioteeh公司的产品进行双向电泳介绍，设备的选择我们在1、2节中介绍。
1.1 双向电泳的介绍双向电泳是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛运用的方法。
这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤——等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（PI）将蛋白质分离。
在第二向步骤中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量（MW）大小将它们分离。
二向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳在1975年由P.H.OFarrel[1]和J.Klose[2]提出，在早先的技术中，第一向分离在含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶载体中进行，这种胶在狭窄的试管中灌注而成。
样品放入管胶的某一端，并且在很高的电压下将它们分开。
在完成等电聚焦（IEF）以后，凝胶棒从管子中取出来，在SDS样品缓冲液中平衡。
随后，放在垂直SDS—聚丙烯酰胺凝胶上，进行第二向分离。
自从双向电泳被被提出以来，双向电泳作为生化分离技术的重要性事实上早已被承认。
但是，它是在最近几年被广泛应用的，由于在各方面的改进。
■2—D技术被改进而产生了2—D的图象，这在分辨率和重复性上有很大提高。
这项新技术是由A.Gorg和他的同事发明的。
在2—D技术中，使第一向电泳得到了改进，利用固定的pH梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并且用塑料胶片支撑的凝胶条代替了柱状凝胶。
在章节3.1“Background to IEF”中阐述了这种技术的优越性。
蛋白质纯化实验
蛋白质纯化实验实验技术简介：双向电泳（two-dimensional electrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
【晶莱生物】实验操作流程：1、样本制备2、固相预制胶条水化3、第一向等电聚焦（IEF）4、胶条平衡5、第二向SDS-PAGE电泳6、凝胶染色检测7、图片扫描实验注意事项：客户提供：1、原样（组织、细胞、菌体等）湿重不少于200mg。
2、蛋白提取物，浓度不少于4ug/ul，总量不少于5mg。
3、寄样须知：样品需低温保存，用干冰保存快递。
交付标准：1、双向电泳电子图片及定量分析结果，包括差异点号码、差异倍数。
2、差异点的一级质谱或二级质谱峰图，质谱鉴定结果，包括pI和MW等。
3、双向电泳完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。
一、仪器设备色析管柱（Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、铁架、铁夹及水平仪；部分收集器（fraction collector, 需准备干净试管约100 支）；浓缩用离心机（低速5,000 rpm）；浓缩用离心管Centriprep-30 （Amicon 4322）请注意其使用方法。
二、药品试剂胶体Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 预先以缓冲液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。
b. 胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。
c. Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。
Buffer A-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合（Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每组取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1 350）三、管柱装填1. 以纯水冲洗玻璃管柱（以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。
双向电泳
另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：
H2O
H++OH－
使溶液的pH有所改变。当某一两性电解质的pI较低，即释
放质子（ H+ ）能力较强，使溶液 pH 值下降，这类两性电
解质称为酸性两性电解质；而pI高的两性电解质可使溶液
1.2.1组合摸式：双向电泳主要是电荷分离——分子质量分 离的组合摸式。 （ 1 ）第一向为电荷分离：通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳将样品按蛋白质等电点的差异进行分离。 （ 2 ）第二向为质量分离：通过 SDS— 聚丙稀酰胺凝胶电 泳按相对分子质量大小不同进行分离。
1.2.2分类：双向电泳根据其第一向使用的介质的不同可以
们到达净电荷为零的位置时才停止。
具有最低和最高等电点的分子带电荷最多，泳动速度最快， 所以pI梯度的形成开始在正、负级两端，然后不同pI的载 体两性电解质分子逐渐到达它们自己的等电点位置而形成
一个连续的pI梯度。如图所示。
A
B
C
载体两性电解质在电场中形成pI梯度的模式图
A 原始状态 B pI梯度的形成过程 C连续pI梯度的形成
出的优点。
图 等电聚焦的“聚焦效应”
等电聚焦电泳根据蛋白质等电点不同而将其分离，也可以根据蛋白 条带在pH梯度中形成的位置测定其等电点。
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
3.1蛋白质-SDS复合物
(1)SDS的作用：SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中
以单体和分子团(micellae)的混合形式存在，作为一种变性
中存在三个物理效应和四个不连续性的分离系统。
3.2.1三个物理效应
蛋白质双向电泳简介
样品中核酸的去除
对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成 复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切 酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质 （SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通 过超速离心来去除复合物。
注意事项
双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽 可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐 离子等干扰物质
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变 化的一门科学
研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、 修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最 终确定它们的功能
仪器设备
原理
双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大 小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质 群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理 化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质 的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷 的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子 量的不同将之分离。
通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂 的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可 用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基 质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂 尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以 打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型 或两性去污剂以破坏疏水交互作用。
IPG 胶的水合及上样
2-DE 样品
水合溶液
IPG 胶条支或 CHAPS
2%
IPG缓冲液 (两亲性电解液)
0.28% DTT
微量 溴酚蓝
IPG 胶条 定位
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第一向等电聚焦（IEF）
图示：Ettan IPGphor3等电聚焦仪器和Ettan IPGphor3控制软件双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。
IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。
可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。
IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。
最新推出的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG 胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。
1．IPG胶条的水化和电泳
（1）仪器：IPGphor
（2）试剂：水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mM DTT和0.5%IPG缓
冲液）：水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20℃保存，但不可反复冻融，尿素溶液加热温度不能超过37°C，否则蛋白会发生氨甲酰化)。
（3）实验步骤：
1）用样品溶解缓冲液(9M尿素，4%CHAPS，2%IPG缓冲液，40mM DTT，40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml(若浓度过高，可以加Lysis buffer稀释)，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2）吸取适量(见表2.1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表2.1IPG胶条所需水化液体积
3）从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中（酸性端抵住胶条槽底端），慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。
4）IPG胶条上覆盖适量（1.5mL）Immobiline DryStrip覆盖油（从两侧往中间加），盖上盖子。
5）将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与IPGphor仪器的阴极平台接触（在此过程中，需用水平仪检查平台是否平衡，然后用两块白色条形板压在胶条槽上，最后盖上IPGphor的盖子）。
6）设置IPGphor仪器运行参数：IPG胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。
电泳参数见表2.2 。
表2.2：IPGphor运行条件
低电压时水化，有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。
7）IPG胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。
8）暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C保存几个月。
注意：不推荐每条IPG胶条的电流超过50μA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG胶条甚至会烧胶。
附注：一向等电聚焦电泳需21-22h
2．IPG 胶条的平衡
IPG 胶条平衡两次，每次15min 。
平衡缓冲液包括6M 尿素和30%甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。
第一步平衡在平衡液中加入DTT ，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT 烷基化(银染过程中，DTT 会导致点拖尾"point streaking") 。
将IPG 胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向SDS 胶中。
注：如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从IPG 胶条转移到SDS 胶的效率。
这种情况下建议在蛋白从 IPG 胶条转移到SDS 胶后，将IPG 胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开IPG 胶条。
（1）仪器：平衡管 (200 mm 长, 20 mm i.d.), Parafilm, 水平式摇床
（2）实验步骤：
1）使用前每10ml 平衡缓冲液中加入0.1g DTT (相当于平衡缓冲液I )
，
取出IPG胶条分别放入平衡管中(支持膜贴着管壁，每个平衡管中放入一条IPG胶条)，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟，倒掉平衡缓冲液I。
2）每10ml平衡缓冲液加入0.3g碘乙酰胺(相当于平衡缓冲液II)。
将IPG 胶条转移至平衡缓冲液II中，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟。
（注：平衡缓冲液Ⅰ和Ⅱ用同一平衡管，即先用DDT平衡，缓缓地倒掉DDT，小心别把IPG胶条倒掉，再加入IAA进行平衡即可。
每根胶条一般需10ml平衡液，如若要平衡3根胶条，洗2个50ml离心管，分别称量0.1g×3=0.3g DDT和0.3×3=0.9gIAA，各加入30ml）。
附注：在胶条平衡未完之前，进行剥胶，用ddH2O冲洗胶板，去除板上碎胶，并加满ddH2O置于支架上，一段时间后，将ddH2O倒掉，用滤纸片吸干水分，并吸取加热后的琼脂糖密封液灌满胶板空隙。
3）IPG胶条的转移：用镊子取出IPG胶条，将胶条的支持面（即带字的面，不能是胶面）边缘置于滤纸上几秒钟，以去除多余的平衡缓冲液，并将胶条浸泡在2×SDS电泳缓冲液中数秒钟。
然后，将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持面贴着其中的高板，用一薄尺将IPG胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。
确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。
4）最后往胶板空隙中补满琼脂糖密封液（温度不高于65℃），使IPG 胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡，放置一会儿，直至凝
固。
附注：配置新鲜上槽液1.2L=480mL+ddH2O至终体积（将5×Laemmli SDS 电泳缓冲液稀释至2×，加水至），用1mL的量筒配置并存放（因为在转移IPG胶条之前，先得在缓冲液中浸泡数秒钟）倒入Ettan DALTsix 上槽中，下槽液为1×电泳缓冲液，可重复利用。
缩略词表：
IPG：immobilized[ɪ'mobɪ,laɪz] PH gradient。