IEF-PAGE聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法
电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳
.电泳技术.第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术.常见电泳技术第二节纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE.PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。
.1、聚丙烯酰胺凝胶的特点①可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”④电泳分离的重复性好⑤透明度好，便于照相和复印⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存.⑦无紫外吸收⑧可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素.（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= abmbab100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.5−0.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。
当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳
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(6)剪取加样纸:
按坐标纸的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加样纸,拨去上
下覆盖的保护纸,取出8层擦镜纸作为加样纸,根据样液浓度
调节加样纸的层数(标准样4层,其它样液均为8层).
(7)加样:
将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的
凝胶中央.
(8)连接电极:
将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上电极板,使铂
带。
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2.3.两性电解质 (1) Ampholine(瑞典LKB) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组 成的, pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.
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(2) Servalyte(德国Serva公司) 它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺 混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的. pH范围:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.
金丝压在电极条上.盖上安全可编罩辑p,p接t 通冷凝水.
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(9)电泳:
将电泳仪正极输出端与磷酸电极条相连, 负极输出端与
NaOH电极条相连,接通电源,60V恒压15min, 8mA恒流至
电压上升到 550V,关闭电源,揭去加样纸, 然后在550V恒
压3小时左右,等电流降至接近于零,停止电泳.
(10)固定:
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3.2pH梯度的形成过程 pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度 而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm， 凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质, 电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。
该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。
IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。
样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。
当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。
这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。
IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
5、IEF-PAGE
等电聚焦示意图
双向电泳示意图
双向电泳图谱
电泳装置
操
1. 凝胶柱的制备
作
方 法
（1）玻璃管先用小片的封口膜封口，然后将封口的一端插在 橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中 先加2-3滴30%的甘油或者40%蔗糖) （2）配胶 （按照黑板上的配方加入相应的溶液） 表 凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 30%凝胶贮存液 1.3 ml 蒸馏水 1.9 ml 2mg/ml蛋白质样品 1.5 ml 40%两性电解质载体 0.48 ml TEMED 0.004 ml 充分混匀后 加入10%过硫酸铵 0.04 ml
理想的载体两性电解质的合成
用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六 胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合 反应优先加在α、β饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比 例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机合成 不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求 合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证 的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑 的pH梯度。 载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在 300-1000之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性 能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好， 在1%水溶液中的紫外吸收值（260nm）很低。
解
疑
1、在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 答： 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到 所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系 的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 2、为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 答：等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值 区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电 解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。
二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。
它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。
近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。
由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。
等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。
这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。
本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。
理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。
常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。
合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。
这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。
混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。
目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。
不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。
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【实验目的】
1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理
2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法
【实验原理】
等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。
当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。
蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。
当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。
当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。
这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。
利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。
【实验材料】
1.实验器材
小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计
2.实验试剂
(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。
(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。
此蛋白溶液应无盐离子。
(3) 5%磷酸溶液
(4) 2%氢氧化钠溶液
(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。
(6) 40%蔗糖溶液
(7) 12%三氯醋酸溶液
(8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。
【实验操作】
1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。
2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。
放置约0.5～1小时，观察凝胶的凝聚情况。
3. 管内凝胶凝聚后，用滤纸将顶端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，让蔗糖溶液流出，并用少量蒸馏水清洗，然后将小玻璃管垂直放入圆盘电泳槽中。
上槽加入5%磷酸溶液，接正极，下槽加入2% NaOH溶液，接负极，于150V条件下进行聚焦，过一段时间后（约2～3小时），电流稳定不变时（基本为零），说明聚焦完毕。
4. 聚焦结束后取出小玻璃管，迅速用蒸馏水将两端洗净。
用一带长针头的注射器灌满蒸馏水，并将针头紧贴玻璃管内壁插至凝胶和管壁之间，转动玻璃管，同时推动注射器，并使针头在管壁与凝胶间前进，注入蒸馏水，使凝胶胶条从玻璃管中脱出。
5. 将其中一根凝胶胶条浸于12%三氯醋酸溶液中固定2小时，白色蛋白区带即出现。
再浸于考马斯亮蓝染色液中染色5小时。
取出后，转移至脱色液中脱去背景颜色。
6. 将另一根凝胶胶条按顺序切成0.5cm长的小段，分别浸泡于1.0ml蒸馏水中过夜，用pH计测定pH值。