聚丙烯酰胺凝胶电泳

② 缓冲离子的不连续性 ③ pH的不连续性 ④ 电位梯度的不连续性 制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶 pH6.7 分离胶pH8.9 电泳缓冲液：Tris-甘氨酸 在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少， 在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者 之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者 之间泳动。
1、作用
分离蛋白质、核酸
2、概念
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝 胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶 具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、 对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点， 是一种很好的电泳支持介质。
3、原理
聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联 剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下 合成。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电 荷效应、分子筛效应。
注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性 条件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧， 隔绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
（2）光聚合：核黄素-TEMED系统
核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外 光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有 氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素， 其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意： 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚 合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致 孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。
凝胶总浓度T ——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。 T=（a+b）/m×100% T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。 T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。 C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/（a+b）×100% 当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）
（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
（根据亚基分子量分离蛋白质）
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加 入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电 泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷 因素可以忽视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚 (1)SDS （十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
(2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带形 成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到 一起，浓缩为一狭窄的区带。 样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH 的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直 接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。
3、分类
按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳
按凝胶系统的均匀性分
连续PAGE 不连续PAGE
电荷效应
分子筛效应
连续电泳 PAGE
电泳体系中所用的缓冲液 成分、pH、凝胶浓度相同 浓度及电位梯度呈不连续性 电荷效应 分子筛效应
不连续电泳 缓冲液离子成分、pH、凝胶
浓缩效应：不连续性所致
不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好， 分辨率高，是最常用的体系。
实验原理
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SDS和还原剂的作用：
（1）分子被解聚成组成它们的多肽链
（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的
蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷
达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同
分子之间原有的电荷差异。
不连续SDS-PAGE
1.原理
凝胶的不连续性 缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性
浓缩胶 pH6.7
分离胶 pH8.9
① 凝胶的不连续性：
浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递 减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。 分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻 力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁 移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔 胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）
分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的
大小形状不同所致）
（1）丙烯酰胺结构式
（2）亚甲双丙烯酰胺
PAGE 的 聚 合
需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体 带有游离基，从而与Bis进行聚合。 （1）化学聚合：AP-TEMED系统 过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺 （TEMED）为加速剂。 AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰 胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺， 然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42- 。
不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率 与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅 可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测 定蛋白质亚基的分子量。
PAGE的浓度与孔径的关系
PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的 浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选 择合适的单体浓度。 Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性； ＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）形状像一个长椭圆棒
（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相

同的
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于 椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。
2.凝胶浓度的选择
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度， 只取决于分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，因 此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。