聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
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把膜置于第二抗体中，温和振荡2小时
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在TBST中洗膜1小时，中间更换4次
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显影，定影这一步骤为最重要的步骤之一，非常容易出现问题，必须小心仔细，我们在实验中采用的是上海康成公司生产的第二代化学超敏发光试剂盒，说明书另附PDF。在实验中发现有时发光很快减弱；肉眼可以看到发光，但是底片显不出来等问题。联系了康成公司的技术员，改动如下：膜与发光显色剂接触时间改为2分钟（不是说明书中的5min），底片压片时间2分钟。显影时有一些基本的原则，如严格的避光，压片前注意排除气泡，压片过程中底片不能接触液体等，按照一定的规则放置膜。将底片压片曝光结束后，将其中一角折起以助定位。定影后将膜贴于显出的条带，条带旁表明marker条带。底片注明实验日期、名称。
（2）分类
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot（以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cruz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。
其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml 与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。
(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脱色液 7％醋酸溶液。
3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。
最新省时6 %变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验试剂及配制：a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。
丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。
b,变性剂。
1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。
C, 固定液。
100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。
d, 银染液。
硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。
f, 显影液。
无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。
DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。
预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。
灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。
聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。
电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。
拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。
打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。
预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。
固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。
漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍，每次 2 ～ 3 min。
染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇动染色 30 ～ 40 min。
显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显影直到带型完全出现。
高中生物 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验四蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。
系统中所有组分都含有0.1% 的SDS(Laemmli, 1970)。
样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。
此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。
从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。
这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。
在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。
这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近1：20 时孔径达到最小值。
SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
生物化学实验-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 电泳缓冲液：Tris、甘氨酸。
• 染色剂：考马斯亮兰R250 浓度为2.5g/L，用甲醇∶醋酸∶ 蒸馏水=5∶1∶5的溶液配制（V/V）。
• 脱色剂：醋酸 取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。
各试剂的作用
• Acr： Bis： Acr与Bis共同成为分子筛的主体。 • APS：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ化剂 TEMED：加速剂
SDS与蛋白质形成复合物（1g蛋白质与1.4g SDS结合），而
SDS的负电荷大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了 不同种蛋白质间原有的电荷差别，使复合物都带上相同密度 的负电荷。SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白 质—SDS复合物形成长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短
轴长度都一样，约为18埃，这样的蛋白质—SDS复合物在凝
a，b的比例很关键，如果a:b <10，胶脆，硬；
如果a:b > 100，胶糊状。 一般有弹性，透明的胶，a:b比例应在30左右
丙烯酰胺储存液的配制
• 29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存 液：
丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
储于棕色瓶，4℃避光保存。 使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉 淀，可以过滤。 • 注意聚丙烯酰胺具有神经性毒性，要做好防护措施。
斯亮蓝染液摇床染色0.5-1h。
• 脱色 将已染色的凝胶板放入醋酸脱色液脱色1-2d，以背景无 色为准。
试剂
• 用于制胶的试剂： 丙烯酰胺(Acr)、N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、过硫 酸铵(APS)，四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠（SDS）、 二巯基苏糖醇（DTT）。 • 缓冲液：Tris、HCl。 • 上样缓冲液：Tris、HCl、蔗糖、溴酚蓝、SDS
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。
30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。
过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。
1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。
同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。
另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。
丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。
N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
聚丙烯酰胺凝胶 配制方法
聚丙烯酰胺凝胶配制方法聚丙烯酰胺凝胶配制方法5×tbe（组份浓度：5×tbe，ph8.3；配制量：1l）：称取53.9gtris，27.5g硼酸，量取20ml0.5mol/ledta（ph8.0），置于1l烧杯中；加入约800ml超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至1l；室温保存。
10%过硫酸铵（组份浓度：10%(w/v)过硫酸铵；酿制量：10ml）：称取1g过硫酸铵，放在10～50ml烧杯中；重新加入约8ml超纯水，烘烤熔化；提超纯水将溶液定容至10ml；4℃留存（留存时间为2周左右，少于期限过硫酸铵将丧失催化作用）。
30%丙烯酰胺（组份浓度：30%(w/v)丙烯酰胺；配制量：1l）：称取290g丙烯酰胺，10gn,n'-亚甲基双丙烯酰胺，置于1l烧杯中；加入约600ml超纯水，水浴加热至37℃，充分搅拌至溶解；加超纯水将溶液定容至1l，用0.45μm滤膜过滤除去杂质；并检测该溶液ph值应不大于7；棕色瓶4℃保存。
0.1%agno（0.1%(w/v)agno3；酿制量：1l）：称取1gagno3，3组份浓度：放在1l烧杯中；重新加入约800ml超纯水，；提超纯水将溶液定容至1l；棕色瓶室温留存。
显色液（组份浓度：2%(w/v)naoh，0.04%(w/v)na2co3，0.4%(w/v)37%甲醛；配制量：1l）：称取20gnaoh，0.4gna2co3，置于1l烧杯中；加入约800ml超纯水，充分搅拌溶解；加4ml37%甲醛溶液，加超纯水将溶液定容至1l；室温保存。
10%冰乙酸（组份浓度：10%冰乙酸；酿制量：1l）：量挑100ml冰乙酸，放在1l烧杯中；重新加入约800ml超纯水，烘烤搅匀；提超纯水将溶液定容至1l；室温留存。
2.2.6电泳检测2.2.6.1玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反反复复冲洗；然后用ⅲ级蒸馏水冲洗2～3次，直到玻璃板表面发生光滑水膜，既不T4300水滴，也未成股泣不成声；再用超纯水冲洗1次，晒干；最后用无水乙醇冲洗，晒干水泵[74]。