实验五 等电聚焦测蛋白质等电点
蛋白质等电点的测定2讲课文档
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。
放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脱色液 漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋 白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。
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5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
现在十四页，总共十八页。
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端
1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂 直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
固定染色前凝胶条长度
固定染色后凝胶条长度
现在十七页，总共十八页。
三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
0.01M醋酸（ ml）
0.6
8.7
—
8.0
—
7.4
—
0.1M醋酸（ ml） —
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
—
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。
根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。
不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。
一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。
在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。
2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。
该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。
IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。
其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。
将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。
加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。
每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。
将记录的数据制成曲线图。
由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。
将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。
（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。
b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。
生化大实验
目录
实验一 蛋白质含量的测定 实验二 离子交换法血清纯化IgG 实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白 实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 实验五 等电聚焦法测定样品的等电点 实验六 质粒的分离与纯化 实验七 PCR扩增目的基因片段 实验八 酶联免疫吸附实验
实验一 蛋白质含量的测定
（一）考马斯亮蓝法
表1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度---标准曲线的绘制
项目 标准蛋白液/ml
蒸馏水/ml 蛋白质浓度/ml
A280
1 2 3 4 5 6 78 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 0.125 0.25 0.375 0.50 0.625 0.75 1.0
《生化大实验》
实验课程简介
生化大实验是一门综合性的实验课程， 教学的目的在于通过对生命物质的分离制 备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握 的基础生物化学理论知识和生化实验常用 方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、 比色、层析、电泳等）的基础上，训练学 生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、 核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技 术。
【试 剂 和 器 材】 1. 2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液 2. 容量瓶10ml（×6） 3. 试管1.5cm×15cm（×8） 4. 双缩脲试剂：溶解0.175g硫酸铜（CuSO4
5H2O）溶于15ml水中，在100ml容量瓶中加入30ml 浓氨水、30ml冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠，摇匀， 室温1-2h定容100ml，摇匀备用。在搅拌下加入 300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml， 贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若 贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
蛋白质与蛋白质组学实验指南
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感谢支持！(Thank you for downloading and checking it out!)蛋白质与蛋白质组学实验指南一、蛋白质组学基础蛋白质组学是一门综合性学科，旨在研究生物体内所有蛋白质的结构、功能、表达调控以及相互作用。
蛋白质组学研究对于揭示生物学过程中的分子机制、疾病发生发展规律以及药物作用机理具有重要意义。
本文将从蛋白质组学概述、蛋白质组学研究方法以及蛋白质组学应用领域三个方面进行介绍。
蛋白质组学概述蛋白质组学是在基因组学、转录组学和翻译组学的基础上发展起来的，它研究的是生物体内所有蛋白质的表达、修饰、相互作用以及功能。
蛋白质组学的发展涉及到多个学科，如生物信息学、生物技术、生物物理学和分子生物学等。
蛋白质组学研究对象不仅包括蛋白质的结构和功能，还包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质之间的相互作用等。
蛋白质组学研究方法蛋白质组学研究方法主要包括蛋白质分离、蛋白质鉴定、蛋白质定量以及蛋白质功能分析等。
在蛋白质分离方面，常用的技术有凝胶渗透色谱、离子交换色谱、亲和色谱等。
蛋白质鉴定主要采用质谱技术，通过测定蛋白质的肽质量指纹图谱来识别蛋白质。
蛋白质定量方法有西方印迹法、定量PCR等。
此外，蛋白质组学还可以采用蛋白质芯片技术、蛋白质蛋白质相互作用网络分析等方法来研究蛋白质的功能。
蛋白质组学应用领域蛋白质组学在多个领域具有广泛的应用，包括疾病机理研究、药物研发、生物标志物发现、个性化医疗等。
在疾病机理研究中，蛋白质组学可以帮助研究者发现与疾病相关的蛋白质及其相互作用网络，从而揭示疾病的发生发展规律。
等电聚焦电泳 介绍
等电聚焦电泳介绍点击次数：315 作者：佚名发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。
其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。
重庆大学生物化学实验_实验五 蛋白质pI测定
原理
NH2
H+
P
COO- OH-
NH3+
H+
P COO- OH-
NH3+ P
COOH
当溶液的 pH 达 到一定数值时，Pr 便 呈兼性离子形式，此
pH pK lg [ A ] [ AH ]
时的 pH 称 Pr 的 pI；
在溶液的 pH = pI 时， Pr 的黏度、渗透压、 膨胀系数及溶解度等 均降低；
实验五、蛋白质 pI 的测定
问 题：
1、为什么说蛋白质是两性电解质？ 2、什么叫等电点？ 3、我们依据什么方法来检测，其原理是什 么？ 4、我们检测的材料是什么？怎样才知道其 等电点？
Pr 为两性电解质，除了含有自由 羧基、氨基外，还有酚基(Tyr)、巯 基(Cys)、胍基(Arg)、咪唑基(His) 等可解离基团。
1 pI 2 ( pK1 pK2 )
主要器材
操作
试管编号
1
2
3
4
加 0.1N醋酸钠 2
2
2
2
入液
的 0.1N醋酸 0.25
0.50
2.0
/
试
剂 1N醋酸
/
/
/
0.8
ml 蒸馏水
3.75
3.50
2.0
3.2
1%白明胶 2
2
2
2
溶液最终PH值 沉淀
蛋白质等电点的测定实验报告
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。
2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。
3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。
当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。
本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。
醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。
在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。
用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。
2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。
3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。
在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。
接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。
4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。
取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。
5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。
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实验五等电点聚焦测蛋白质等电点
Mangogola
等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。
载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。
经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。
蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。
聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。
最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。
一．实验过程
1.圆柱体凝胶制备
用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。
凝胶T=%，C=%，共4mL
30%Acr，%Bis 1mL
10%过硫酸铵
双蒸水
载体两性电解质
样品液（BSA-10mg/mL）
样品液（肌红蛋白-5mg/mL）
TEMED
共作三支管，每管加胶液约
2.聚焦电泳
在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。
接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。
3.蛋白质染色及等电点测定
用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。
将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，
浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。
另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰
色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。
二．数据记录和处理
1.标准曲线绘制
初始数据如下表：
标号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH值
由于存在碱端漂移，舍去前三个数据，将其余数据对凝胶长度作图，得标准曲线如下图：
即所得的标准曲线为计算样品等电点 总长/cm 1肌红蛋白距碱端距离/cm 2BSA 距碱端距离/cm
d1/cm d2/cm 胶条1 胶条2 8
注：d=
将胶条1和胶条2数据带入求平均值得： 肌红蛋白的等电点pI=；BSA 的等电点pI=。
三．注意事项
1.本实验凝胶选用化学聚合方法，而没有采用核黄素，是因为核黄素很难溶于水，经常失效，光照不合适难以聚合。
2.灌胶时要快速细致，出现气泡要及时将其弹震出去。
3.剥取胶时应将针头紧贴玻璃管壁，边向下延伸边注水，小心剥取。
4.剥出的胶条放置在平皿中，要及时吸干周围的水分，防止其中电解质溶解出来。
13
胶条总长
样品距碱端距离。