蛋白质沉淀与等电点
蛋白质的性质实验二-蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质沉淀反应结果分析
要点一
蛋白质沉淀反应原理
当溶液的pH值低于或高于蛋白质的 等电点时，蛋白质带负电荷或正电荷 ，容易与其他带相反电荷的物质发生 静电吸引而产生沉淀。沉淀反应可用 于分离纯化和测定蛋白质含量。
要点二
实验结果
实验观察到在pH值低于或高于等电 点时，蛋白质出现沉淀现象。通过离 心分离和称重，测定了沉淀物中蛋白 质的质量和含量。实验结果表明，该 蛋白质在不同pH值下的沉淀效果显 著，可用于蛋白质的分离纯化和含量 测定。
实验试剂
盐酸、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、磷酸盐缓冲液等。
配置不同pH值的缓冲液
选择适当的缓冲液，如醋酸-醋酸钠缓 冲液、磷酸盐缓冲液等。
根据需要配置不同pH值的缓冲液，确 保缓冲液的准确性和稳定性。
蛋白质溶液的等电点测定
将蛋白质溶液与不同pH值的缓冲液混合，观察蛋白质的溶解度变化。
当蛋白质溶解度最低时，记录对应的pH值，即为该蛋白质的等电点。
了解蛋白质的沉淀反应及原理
沉淀反应
蛋白质在某些条件下，失去溶解性从 溶液中析出的现象。
原理
蛋白质的沉淀反应通常与溶液的pH值 、离子强度、温度等因素有关，当这 些因素发生变化时，蛋白质的溶解度 可能会降低，导致沉淀的产生。
02
实验原理
蛋白质等电点的概念及影响因素
蛋白质等电点
蛋白质分子在溶液中处于净电中性状态时的pH值，此时蛋白质的溶解度最低。
通过测定不同pH值下的蛋白质电导率，确定了蛋 白质的等电点。
在实验过程中，观察到了蛋白质的溶解度变化和 电荷性质的变化。
分析实验结果与理论预期的差异
实验结果与理论预期基本一致，没有出现明显的偏差。
实验结果支持了蛋白质等电点沉淀的理论，即当溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低， 容易发生沉淀。
蛋白质的等电点测定与沉淀实验
实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应姓名：指导教师：实验室：组员：成绩：第三部分：实验记录与分析实验现象记录及分析：（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析1．蛋白质的盐析2．重金属离子沉淀蛋白质3．有机酸沉淀蛋白质4．有机溶剂沉淀蛋白质5．乙醇引起的变性与沉淀第四部分：课后研讨题1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。
适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。
2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
3.氯化汞为何能做为杀菌剂？细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。
（1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。
（2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。
（3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。
（4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。
（5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。
教师评阅：签名。
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀的方法
蛋白质沉淀的方法有以下几种：
1.盐析法
在蛋白质溶液中加入大量的硫酸饺、硫酸钠或氯化钠等中性盐，破坏蛋白质的水化膜和中和电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。
2.等电点沉淀
等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法
3.有机溶剂沉淀
有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法称有机溶剂分段沉淀法。
常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
4.重金属盐沉淀法
其原理是重金属盐可与蛋白质形成不溶于水的蛋白盐沉淀，从达到沉淀蛋白质的目的。
5.生物碱试剂/酸沉淀
蛋白质又可与生物碱试剂以及某些酸结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。
蛋白质的等电点测定与沉淀实验
实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应姓名：指导教师：实验室：组员：成绩：第三部分：实验记录与分析实验现象记录及分析：（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析1．蛋白质的盐析2．重金属离子沉淀蛋白质3．有机酸沉淀蛋白质4．有机溶剂沉淀蛋白质5．乙醇引起的变性与沉淀第四部分：课后研讨题1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。
适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。
2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
3.氯化汞为何能做为杀菌剂？细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。
（1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。
（2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。
（3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。
（4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。
（5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。
教师评阅：签名。
等电点沉淀蛋白质的原理
等电点沉淀蛋白质的原理等电点是指蛋白质溶液中的所有带电位点的总电荷为零时的pH值。
不同蛋白质的等电点不同，与其氨基酸序列和成分有关。
在酸性溶液中，蛋白质带正电荷，而在碱性溶液中，蛋白质带负电荷。
当蛋白质溶液的pH值等于其等电点时，蛋白质的带电荷最少，对于绝大多数蛋白质而言，此时它们不带电荷或带最少电荷。
当溶液的pH值改变时，蛋白质的电荷状态也会改变。
第一步：溶液调节在这一步，需要根据目标蛋白质的等电点，调节溶液的pH值使其接近或等于目标蛋白质的等电点。
方法是添加酸性或碱性物质以改变溶液的pH值。
如果目标蛋白质为带正电荷的蛋白质，则将溶液调节为碱性；如果目标蛋白质为带负电荷的蛋白质，则将溶液调节为酸性。
当溶液的pH值接近或等于目标蛋白质的等电点时，蛋白质的带电荷最少，溶液中的蛋白质分子会发生相互吸引而凝聚。
第二步：沉淀分离在溶液调节后，蛋白质会发生相互吸引而凝聚成沉淀物。
此时可以采用离心、过滤等分离方法将沉淀物与溶液分开。
离心是一种常用的方法，通过加速样品旋转，使重的物质沉淀在离心管底部。
离心后，上清液中会得到净化后的目标蛋白质，而沉淀物中可能包含其他杂质蛋白质。
此时可以通过再次溶解和沉淀来进一步纯化目标蛋白质。
总的来说，等电点沉淀利用蛋白质在其等电点附近不带电荷或带最少电荷的特性，通过调节溶液pH值，使蛋白质凝聚和沉淀。
这是一种简单易行的方法，可以用于初步分离和纯化蛋白质。
但需要注意的是，等电点沉淀方法无法将pI值较接近的蛋白质分离开来，因此在一些情况下可能需要结合其他分离方法来进行进一步的纯化。
实验蛋白质的等电点测定和沉淀反应
2. 重金属离子沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加3% 硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。
离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉 淀是否溶解？为什么？
3．有机酸沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可 因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
➢ 可逆的沉淀反应
蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引 起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原 来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间 作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
甲基红溶液：pH变色范围为4.4-6.2，由红变黄
四、实验操作
（一）酪蛋白等电点的测定
（1）取4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。
试管号 蒸馏水 0.01 M醋酸 0. 1 M醋酸 1. 0 M醋酸
mL
mL
mL
mL
1
8.4
0.6
-
—
2
8.7
-
0.3
—
3
8.0
-
1.0
—
4
7.4
-
-
1.6
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为 5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一 管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质沉淀实验
1. 蛋白质的盐析
加5%卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量 饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球 蛋白的沉淀。
实验蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
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3
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离 的正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值 为该蛋白质的等电点。
不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白 质的组成结构有关。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可 利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
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（二）蛋白质沉淀实验
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15
1. 蛋白质的盐析
加5%卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量 饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球 蛋白的沉淀。
离心，取沉淀，加少量水，观察是否溶解。 离心后上清液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为
止，此时析出的沉淀为清蛋白。 离心，取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察
实验一、蛋白质等电点 测定及沉淀反应
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1
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系
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2
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
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5
在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水 化层和双电层而成为稳定的亲水胶体。
在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可 因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
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6
➢ 可逆的沉淀反应
蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引 起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原 来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
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实验一蛋白质的等电点测定和沉淀反应
实验结果
（一）酪蛋白等电点的测定
管号 pH值 混浊度 1 2 3 4
解释现象
（二）蛋白质沉淀实验 1．蛋白质的盐析
蛋白质溶液中 加硫酸铵溶液
加水
现象
上清液中加硫 酸铵粉末
加水
解释
2．重金属离子沉淀蛋白质
蛋白质溶液 中加硝酸银
沉淀能否重新溶解。
2. 重金属离子沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加3% 硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。
离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉 淀是否溶解？为什么？
3．有机酸沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
沉淀中加水
现象
解释
3．有机酸沉淀蛋白质
蛋白质溶液中 加三氯乙酸
沉淀中加水
现象
解释
4．有机溶剂沉淀蛋白质
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管号 1 2
3
操作 振荡混匀 加数滴盐酸 振荡混匀 醋酸中和 加数滴盐酸 振荡混匀 碳酸钠中和 加数滴盐酸
离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察
沉淀是否溶解。
4．有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2 mL蛋白质溶液，再加
入2 mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生 成。
5．乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂：
试剂 5%卵 0.1 M 0.1 M pH4.7 95%乙
mL 清蛋白 氢氧化 盐酸 缓冲液 醇
在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可 因失去电荷和脱水而沉淀。
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思考题及注意事项
思考题
1、维持蛋白质胶体稳定性的因素是什么？ 2、实验中判断等电点的标准是什么？
注意事项
1、等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和 加入量必须相当准确。
（1）盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从 溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响 下，蛋白质分子的水化膜被剥夺；同时蛋白 质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白 质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但 中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质， 因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白 质就会重新溶解。
（2）有机溶剂沉淀蛋白质：在蛋白质溶液 中加入适量丙酮或乙醇，蛋白质分子的水化 膜被破坏而沉淀。若及时将蛋白质沉淀与丙 酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于 水中。
2.不可逆沉淀作用 ：一些物理化学因素往往 会导致蛋白质分子结构，尤其是空间结构破 坏，因而失去其原来的性质，这种蛋白质沉 淀不能再溶解于原来的溶剂中。重金属盐， 生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超 声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆 沉定。
（1）重金属盐类:能与蛋白质分子中的巯基等 基团结合，生成不溶物而沉淀。
1.可逆沉淀作用：在发生沉淀作用时，虽然 蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构 并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和 性质。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解 在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为 可逆沉淀作用。属于此类的有盐析作用，低 温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及 利用等电点的沉淀。
蛋白质的沉淀作用和等电点测定
【实验目的】
1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。 4. 学习蛋白质的两性解离性质。 5. 掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
【实验原理】
一、沉淀作用
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成 水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒， 在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因 失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应 可分为可逆的沉淀反应和不可逆沉淀反应两 类。
二、等电点
蛋白质和氨基酸一样都是两性电解质。调 节蛋白质溶液的pH值，可使蛋白质分子侧链或 末端携带不同的电荷；在某一pH时其分子中的 正电荷与负电荷数目相等，即净电荷为零，该 pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质 的溶解度往往较低容易沉淀析出。本实验借助 观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的 等电点。
（2）生物碱试剂:与蛋白质结合形成不溶物而
沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性 化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物 碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂， 如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条 件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性 蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白 质也未必都已变性。
（4）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支试管， 加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。观 察沉淀的生成。
【实验步骤】
（5）乙醇引起的变性与沉淀 a. 取3支试管编号，依下表顺序加入试剂。
b . 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置 片刻，向各管内加水8ml，然后在第2、3号 管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 mol/L 醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。 观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管 再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的 再溶解。解释各管发生的全部现象。
【实验步骤】
1、蛋白质的沉淀反应
（1）盐析 加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中， 再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分 钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀， 加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内 容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶 解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉 淀的再溶解。
【实验步骤】
（2）重金属离子沉淀蛋白质：重金属离 子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取1 支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝 酸银溶液1～2滴，振荡试管，有沉淀产生。 放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量 的水，沉淀是否溶解？为什么？
【实验步骤】
（3）某些有机酸沉淀蛋白质：取1支试管， 加入蛋白质溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶 液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻， 倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉 淀是否溶解。
【实验步骤】
2、酪蛋白等电点的测定 ⑴ 取同样规格的使馆4支，按照下表顺
序分别精确加入各试剂，然后混匀。
⑵ 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸源自溶 液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、 4管的pH 依次为5.9、5.3、4.7、3.5.观察 管溶液的混浊度。静置10分钟后，再观察其 混浊度。最混浊的一管的pH 即为酪蛋白的 等电点。注：观察时，用“＋”,“－”表 示沉淀的多少。
【实验材料和主要仪器、试剂】 1.实验材料
蛋白质（卵清蛋白）、酪蛋白
2.实验仪器
试管及试管架；刻度吸管；吸耳球、胶头 滴管、pH试纸
3.实验试剂
pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；3%硝酸银 溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；饱和硫酸 铵溶液；硫酸铵结晶粉末；0.1mol/L盐酸溶 液；0.1mol/L氢氧化钠溶液；0.05mol/L碳酸 钠溶液；0.1mol/L醋酸溶液；甲基红溶液； 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液；醋酸溶液（mol/L）： 1.0, 0.1 ,0.01。