蛋白质等电点的测定
实验三蛋白质等电点测定-文档资料
蛋白质等电点测定
• 二、操作 1. 取4支洁净的试管，按表顺 序分别精确加入各试剂，然 后混匀。 2. 向上述试管中各加入酪蛋白 的醋酸钠溶液1ml，随加随摇。 观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。混浊 度以‘＋’的多少来表示。 沉淀最多的一管即为酪蛋白 的等电点。判断其等电点。
• 一、原理 蛋白质是一种两性电解质。在 溶液中存在下列平衡。其解 离状态和程度爱溶液的pH值 影响。当溶液的pH达到一定 数值时，会导致蛋白质颗粒 上正负电荷的数目相等，此 时，蛋白质不移动，此时溶 液的pH值称为该蛋白质的等 电点。等电点时，其溶解度 最小。
2. 不可逆沉淀反应 • 重金属离子沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清1ml+硝酸银 液1滴，观察现象并记录。加水， 沉淀溶解？解释。 • 有机酸沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清2ml+三氯乙 酸1ml，混匀，观察现象并记录。 加水，沉淀溶解？为什么？ • 乙醇引起的变性与沉淀 取 三支试管，编号。按表加入试剂。 混匀后，观察各管有何变化，记 录现象。放置片刻后，向各管中 加水8ml，然后在2、3号管中各 加1滴甲基红，再分别用0.1M的 醋酸和0.05M的碳酸钠中和。观 察各管颜色变化和沉淀的生成并 记录。每管再加0.1M的盐酸数滴， 有何现象发生？记录并解释全部 现象。
• 1. 2.
3.
二、操作 蛋白质的盐析 不同浓度的盐析出不同 的蛋白质。如球蛋白可在半 饱和硫酸铵溶液中析出，而 清蛋白则在饱和硫酸铵溶液 中析出。 取一支试管：鸡蛋清液 3ml+饱和硫酸铵液3ml，混 匀后静置数分钟，观察现象 并记录。然后倒出少量混浊 液，加少量水，沉淀是否溶 解，为什么？向管内添加硫 酸铵粉末到不再溶解为止， 又有何现象？加水，沉淀是 否溶解？记录并解释。
实验六蛋白质等电点测定
实验六蛋白质等电点测定一、实验目的掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理；了解等电点的意义及其与分子聚沉能力的关系。
二、实验原理蛋白质同氨基酸一样，是两性电解质，在不同的pH 水溶液中解离后所带正、负电荷不同。
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态出现，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。
各种蛋白质具有特定的等电点，这时和它所含的氨基酸的种类和数量有关。
如蛋白质分子中含碱性氨基酸较多，其等电点偏碱。
例如从雄性鱼类成熟精子中提取的鱼精蛋白含精氨酸特多，其等电点为12.0～12.4。
如蛋白质分子中含酸性氨基酸较多，则其等电点偏酸。
例如胃蛋白酶含酸性氨基酸残基为37个，而碱性氨基酸残基仅含6个，其等电点为1.0左右。
含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点大多为中性偏酸，约5.0左右。
蛋白质等电点多接近于pH7.0，略偏酸性的等电点也较多。
处于等电点的蛋白质表现电中性，所以在溶液中的稳定性很低，容易沉淀析出。
将酪蛋白溶液分置于连续不同的pH 环境中，通过观察混浊程度可测得酪蛋白的等电点。
三、实验器材1.仪器：试管和试管架、滴管、吸管(1和5mL)、容量瓶。
2.材料：蛋白质。
3.试剂：酪蛋白醋酸钠溶液、0.01mol/L 醋酸溶液、1.00mol/L 醋酸溶液、0.10mol/L 醋酸溶液、1.00mol/L 氢氧化钠溶液。
四、实验步骤取9支粗细相近的干燥试管，编好号后按表5-1的顺序准确地加入各种试剂。
加完后观察上述各管的混浊程度，静置约20min，再视其沉淀情况，以-，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少；根据观察的结果，指出哪一个pH是酪蛋白的等电点(混浊显著或静置后沉淀最多，上部溶液变得最清亮一管的pH 值，即为酪蛋白的等电点);该试管要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。
蛋白质等电点的测定实验报告
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过离子交换色谱法测定蛋白质的等电点，探究蛋白质在不同 pH 条件下的电荷状态变化，进而确定蛋白质的等电点。
二、实验原理。
蛋白质的等电点是指蛋白质在溶液中呈电中性的 pH 值。
在等电点条件下，蛋白质的带电量最小，导致其在电场作用下停止迁移。
本实验采用离子交换色谱法，利用色谱柱对蛋白质在不同 pH 条件下的迁移情况进行监测，从而确定蛋白质的等电点。
三、实验步骤。
1. 将色谱柱连接至色谱仪，并进行平衡处理；2. 取一定浓度的蛋白质溶液，分别调节 pH 值至不同条件下；3. 将不同 pH 条件下的蛋白质溶液加入色谱柱，进行色谱分离；4. 监测蛋白质在色谱柱中的迁移情况，记录不同 pH 条件下的保留时间；5. 根据实验数据绘制蛋白质的等电点曲线，确定蛋白质的等电点。
四、实验数据及结果分析。
通过实验数据处理和分析，我们得到了不同 pH 条件下蛋白质的保留时间，绘制出了蛋白质的等电点曲线。
通过曲线的交叉点，我们可以确定蛋白质的等电点为X。
五、实验结论。
根据实验结果，我们成功测定出了蛋白质的等电点为 X。
这一结果对于进一步研究蛋白质的性质和功能具有重要意义。
六、实验总结。
本实验通过离子交换色谱法测定蛋白质的等电点，取得了较好的实验结果。
然而，在实验过程中仍然存在一些问题，例如实验操作的精度和准确度有待提高。
未来我们将进一步完善实验方法，提高实验数据的可靠性和准确性。
七、参考文献。
1. Smith, A. B., & Jones, C. D. (2017). A review of protein isoelectric focusing: methods, applications, and advances. Critical Reviews in Biotechnology, 37(4), 399-408.2. Wang, L., & Smith, R. (2019). Determination of protein isoelectric point by capillary isoelectric focusing. Journal of Chromatography A, 1601, 132-137.八、致谢。
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过等电点测定方法，探究蛋白质在不同pH值下的电荷性质，从而确定其等电点，并通过实验数据的分析，加深对蛋白质分子结构与功能的理解。
二、实验原理。
蛋白质的等电点是指在特定pH值下，蛋白质分子带有零净电荷的状态。
当pH 值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中的阳离子与阴离子数目相等，呈中性状态。
在此pH值下，蛋白质分子在电场中不受力的作用，因而在电泳过程中停滞不动。
因此，通过等电点测定，可以得到蛋白质的等电点。
三、实验步骤。
1. 制备蛋白质溶液，取适量蛋白质样品，加入适量缓冲液，使得蛋白质浓度为1mg/ml。
2. 调节pH值，将蛋白质溶液分别加入不同pH值的缓冲液中，使得溶液的pH值分别为2、4、6、8、10和12。
3. 电泳，将调节好pH值的蛋白质溶液加载至等电聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，进行电泳分离。
4. 染色观察，电泳结束后，将凝胶板取出，进行染色观察，记录蛋白质在不同pH值下的迁移情况。
四、实验结果与分析。
通过实验数据的分析，可以得到蛋白质在不同pH值下的迁移情况。
当蛋白质分子带有净电荷时，会受到电场的作用而发生迁移。
而在等电点附近，蛋白质分子呈中性状态，不受电场作用而停滞不动。
因此，通过观察凝胶板上蛋白质的迁移情况，可以确定蛋白质的等电点。
五、实验结论。
通过本次实验，我们成功确定了蛋白质的等电点，并得到了蛋白质在不同pH 值下的电荷性质。
这对于进一步研究蛋白质的结构与功能具有重要意义，也为蛋白质的纯化与分离提供了重要依据。
六、实验注意事项。
1. 实验过程中需注意操作规范，避免蛋白质溶液的污染。
2. 实验中所用的缓冲液需提前调节好pH值，确保实验的准确性。
3. 在电泳过程中需注意电场的设置，确保实验结果的可靠性。
七、参考文献。
1. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Gatto, G. J. (2002). Biochemistry (5th edition). WH Freeman.2. 王志刚, 张立志, & 王斌. (2003). 生物化学实验教程. 高等教育出版社.以上为蛋白质等电点测定实验报告。
蛋白质等电点的测定实验原理
蛋白质等电点的测定实验原理蛋白质是一种重要的生物大分子，其功能和结构都与其电荷特性密切相关。
蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）是指在一定条件下，蛋白质具有净电荷为零的pH值。
蛋白质等电点的测定实验原理主要基于蛋白质的电荷特性。
蛋白质分子由氨基酸组成，氨基酸在不同pH值下会带有不同的电荷。
当溶液的pH小于蛋白质等电点时，溶液中的氢离子浓度高于氢离子的解离平衡，蛋白质会带正电荷；当溶液的pH大于蛋白质等电点时，溶液中的氢离子浓度低于氢离子的解离平衡，蛋白质会带负电荷。
只有当溶液的pH等于蛋白质的等电点时，蛋白质带的电荷为零。
蛋白质等电点的测定实验通常采用凝胶电泳技术。
实验首先需要制备一系列pH值递增的缓冲液，将这些缓冲液倒入一个凝胶胶槽中，形成一个pH梯度。
接下来，将待测蛋白质样品与一种带负电荷的实验辅助物质，通常是SDS（十二烷基硫酸钠），混合并进行变性处理。
然后将混合样品加载到凝胶胶槽中，并通电使蛋白质在凝胶中进行迁移。
在凝胶胶槽中，蛋白质会在电场作用下向凝胶胶槽两端的电极迁移。
当蛋白质的pH低于等电点时，蛋白质呈现带有正电荷的状态，会向负极迁移；当蛋白质的pH高于等电点时，蛋白质呈现带有负电荷的状态，会向正极迁移。
只有当蛋白质的pH等于等电点时，电荷为零，蛋白质停止迁移，即在凝胶上形成一个落花电点。
这时，在凝胶上可以看到蛋白质在凝胶中的分离位置，通过分析这个位置可以确定蛋白质的等电点。
蛋白质等电点的测定实验可以通过不同方法进一步优化。
常用的方法有改变凝胶胶槽中的pH梯度范围，改变实验辅助物质的类型和浓度，以及改变电场强度和时间等。
蛋白质等电点的测定是非常重要的，它对于理解蛋白质的电荷状态、性质以及在生物学过程中的功能有着深远的影响。
例如，在药物研发和基因工程中，等电点的测定可以用于纯化和分离蛋白质，同时也可以用于研究蛋白质的结构和功能。
因此，掌握蛋白质等电点的测定方法，对于生物化学和生物技术领域的研究具有重要的指导意义。
蛋白质等电点的测定实验步骤
蛋白质等电点的测定实验步骤1. 什么是蛋白质等电点？好嘞，先来聊聊什么是蛋白质等电点吧。
大家知道，蛋白质就像是我们身体的小工厂，负责各种各样的功能。
而等电点呢，简单来说，就是在某个特定的pH值下，蛋白质的电荷总和刚好为零，嘿，这就像是它们找到了一个“平衡点”。
当pH值低于这个点时，蛋白质带正电；反之，高于这个点时，它们就带负电。
想象一下，就像一场争吵，等电点就是那条让大家和睦相处的“和平线”。
2. 实验准备2.1 需要的材料好了，准备实验之前，我们得先搞清楚需要哪些工具。
你肯定得准备一些基本的实验室设备，比如试管、滴管、pH计这些，当然，还有你要测定的蛋白质样品。
别忘了，搅拌器也是个好东西，能让你的实验更顺利。
哦，还有一些缓冲液，保证我们的pH值能精确控制，不然实验结果可就大打折扣了。
2.2 了解设备在开始之前，先熟悉一下设备。
这可不是开玩笑，pH计可是我们的好朋友，得让它跟你交个底。
搞清楚它的使用方法，如何校准，别等到用的时候手忙脚乱，连“pH”怎么读都不知道，那可就尴尬了。
再说一遍，熟悉设备，真的很重要哦！3. 实验步骤3.1 调制缓冲液现在，咱们正式进入实验环节。
首先，拿出那些缓冲液，按照比例调制好。
记住，别心急，慢慢来。
每次加一点，搅拌均匀。
这个过程就像调配一杯好酒，得让每个成分都和谐相处，才能造就美味。
调好之后，先放一边，让它静静待命。
3.2 测量蛋白质的pH接下来，咱们得把蛋白质样品加入缓冲液。
嘿，这里有个小窍门，把蛋白质溶解得尽量均匀，这样后面的结果才靠谱！然后，慢慢调整pH值，注意观察。
每当你调整一次pH，记得记录下来。
这就像在写日记，记录自己的心情，心情好，实验也顺利。
3.3 找到等电点随着pH的不断变化，注意观察你的样品，看它有没有发生什么神奇的变化。
嘿，等电点就是那个让你兴奋的时刻。
当你发现样品的溶解度降低，或者沉淀出现时，恭喜你，这可能就是蛋白质的等电点了！此时，赶紧记录下这个pH值，就像抓住一条金鱼一样，千万别放跑了。
蛋白质等电点的测定实验报告
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。
2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。
3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。
当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。
本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。
醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。
在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。
用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。
2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。
3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。
在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。
接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。
4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。
取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。
5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。
蛋白质等电点的测定
蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。
在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。
蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。
本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。
方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。
该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。
与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。
等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。
方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。
该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。
等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。
方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。
该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。
在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。
通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。
pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。
三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。
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图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
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四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
6.75
10%过硫酸铵
0.05
10%TEMED
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5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
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三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
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6
实验器材与试剂：
器材： • 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容
量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
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实验步骤：
(1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精 确地加入各试剂，然后混匀。
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝
胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋
白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值
等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的
区带。
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三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
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3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
蛋白质等电点的测定
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1
主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
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2
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中 存在下列平衡：
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蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液 的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值 时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等， 在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不 向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质 都有变化，可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点。
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
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（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
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20
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
8.7
8.0
7.4
0.01M醋酸 （ml） 0.6
—
—
—
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0.1M醋酸 （ml）
—
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
— 1.6
8
(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫 升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的 pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊 度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊 的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
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二、等电聚焦电泳
原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而 又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连 续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能 造成介质pH由酸到碱逐步变化。
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2)各种蛋白质pI不同
3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI 形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH 梯度
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4
最常用的方法是：
①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH ③浊度、分光光度法 ④基于蛋白质与离子交换的作用
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一、测定溶解度最低时的溶液PH
实验原理：
借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定 酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠 混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白 的等电点。