实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定
蛋白质的两性反应实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的两性反应特性。
2. 掌握蛋白质在酸碱环境中的电荷变化及其对溶解度的影响。
3. 学习通过实验观察蛋白质在不同pH值条件下的沉淀现象，并确定其等电点。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的高分子化合物，分子中包含有氨基（-NH2）和羧基（-COOH）等基团。
这些基团在不同pH值条件下可以解离，从而使得蛋白质分子带正电荷或负电荷。
蛋白质的这种性质称为两性反应。
当蛋白质溶液的pH值等于其等电点时，蛋白质分子所带的正负电荷相等，此时蛋白质的溶解度最低，容易形成沉淀。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、蒸馏水、pH试纸、滴管、试管等。
2. 试剂：1mol/L HCl、1mol/L NaOH、1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）、1mol/L硼砂缓冲液（pH 8.5）、1mol/L醋酸缓冲液（pH 4.5）。
四、实验步骤1. 将鸡蛋清用蒸馏水稀释至一定浓度。
2. 分别取适量稀释后的鸡蛋清溶液于试管中。
3. 使用pH试纸测定稀释后的鸡蛋清溶液的pH值。
4. 将1mol/L HCl逐滴加入鸡蛋清溶液中，观察并记录溶液pH值的变化及蛋白质沉淀现象。
5. 重复步骤4，使用1mol/L NaOH、1mol/L Tris-HCl缓冲液、1mol/L硼砂缓冲液和1mol/L醋酸缓冲液分别调节鸡蛋清溶液的pH值，观察并记录溶液pH值的变化及蛋白质沉淀现象。
6. 通过对比不同pH值条件下的蛋白质沉淀现象，确定鸡蛋清溶液的等电点。
五、实验结果与分析1. 在pH 4.5时，鸡蛋清溶液开始出现沉淀，随着pH值的降低，沉淀逐渐增多。
2. 当pH值达到2.5时，沉淀量达到最大，此时蛋白质所带的正负电荷相等，为等电点。
3. 随着pH值的升高，沉淀逐渐减少，当pH值达到8.5时，沉淀基本消失。
六、实验结论1. 蛋白质具有两性反应特性，在不同pH值条件下，其电荷和溶解度发生变化。
2. 通过实验观察蛋白质在不同pH值条件下的沉淀现象，可以确定其等电点。
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验三蛋白质等电点测定-文档资料
蛋白质等电点测定
• 二、操作 1. 取4支洁净的试管，按表顺 序分别精确加入各试剂，然 后混匀。 2. 向上述试管中各加入酪蛋白 的醋酸钠溶液1ml，随加随摇。 观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。混浊 度以‘＋’的多少来表示。 沉淀最多的一管即为酪蛋白 的等电点。判断其等电点。
• 一、原理 蛋白质是一种两性电解质。在 溶液中存在下列平衡。其解 离状态和程度爱溶液的pH值 影响。当溶液的pH达到一定 数值时，会导致蛋白质颗粒 上正负电荷的数目相等，此 时，蛋白质不移动，此时溶 液的pH值称为该蛋白质的等 电点。等电点时，其溶解度 最小。
2. 不可逆沉淀反应 • 重金属离子沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清1ml+硝酸银 液1滴，观察现象并记录。加水， 沉淀溶解？解释。 • 有机酸沉淀蛋白质 取 1支试管，加鸡蛋清2ml+三氯乙 酸1ml，混匀，观察现象并记录。 加水，沉淀溶解？为什么？ • 乙醇引起的变性与沉淀 取 三支试管，编号。按表加入试剂。 混匀后，观察各管有何变化，记 录现象。放置片刻后，向各管中 加水8ml，然后在2、3号管中各 加1滴甲基红，再分别用0.1M的 醋酸和0.05M的碳酸钠中和。观 察各管颜色变化和沉淀的生成并 记录。每管再加0.1M的盐酸数滴， 有何现象发生？记录并解释全部 现象。
• 1. 2.
3.
二、操作 蛋白质的盐析 不同浓度的盐析出不同 的蛋白质。如球蛋白可在半 饱和硫酸铵溶液中析出，而 清蛋白则在饱和硫酸铵溶液 中析出。 取一支试管：鸡蛋清液 3ml+饱和硫酸铵液3ml，混 匀后静置数分钟，观察现象 并记录。然后倒出少量混浊 液，加少量水，沉淀是否溶 解，为什么？向管内添加硫 酸铵粉末到不再溶解为止， 又有何现象？加水，沉淀是 否溶解？记录并解释。
蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质的两性性质及等电点的测定一 实验目的通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。
因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
HRCOOHNH 3+HRCOONH 3+HRCOO H 2NOH在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。
在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。
而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。
所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。
若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。
如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。
本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备(1) 试管架 1个(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支四 实验试剂（1）1mol/L 醋酸溶液：量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL ，加水至50 mL 。
（2）0.1mol/L 醋酸溶液：量取1mol/L 醋酸5 mL ，加水至50 mL 。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定
实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定一、目的和要求1.了解蛋白质的两性解离性质。
2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。
二、原理蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。
当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
三、试剂和器材1.试剂0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸；0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液2.器材试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml）四、操作方法1.蛋白质的两性反应（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。
观察溶液呈观的颜色，并说明原因。
（2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。
（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。
继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？2.酪蛋白等电点的测定（1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。
加入每种试剂后应混合均匀。
试管编号9蒸馏水（ml）2.43.2—1.60.8———2.03.03.51.52.753.38————————加1N醋酸溶液入0.1N醋酸溶液—的0.01N醋酸溶液—试酪蛋白醋酸钠剂溶液最终PH沉淀出现情况4.02.01.00.5—————2.51.250.621.01.01.01.01.01.01.01.01.03.53.84.14.44.75.05.35.65.9（2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。
实验3蛋白质的等电点测定和沉淀反应
实验3蛋白质的等电点测定和沉淀反应实验3 蛋白质的等电点测定和沉淀反应华南师范大学杨兴举一、目的1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。
3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
1、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
二、原理蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固。
蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、材料、试剂与器具（一）材料新鲜鸡蛋（二）试剂1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 200ml取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50?的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
十三蛋白质的两性性质及等电点的测定
实验十三蛋白质的两性性质及等电点的测定一、目的通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、原理蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N-端α-氨基与C-端α-羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。
因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
三、仪器和试剂1．仪器（1）试管架（2）试管：15ml ×6（3）刻度吸管：lml×4，2mI×4，10ml×2（4）胶头吸管×22. 试剂（1）1 mol／L乙酸（2）0.1 mol／L乙酸（3）0.01 mol／L乙酸（4）0.2 mol／L NaOH（5）0.2 mol／L盐酸（6）0.01％溴甲酚兰绿指示剂（7）0.5％酪蛋白四、操作步骤（1）取一支试管，加0.5％酪蛋白1ml，再加溴甲酚兰绿指示剂4滴，摇匀。
此时溶液呈蓝色，无沉淀形成。
（2）用胶头滴管慢慢加入0.2 mol／L盐酸，边加便边摇直到有大量的沉淀生成。
此时溶液是pH值接近酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴加0.2 mol／L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。
观察此时溶液的颜色变化。
（4）滴加0.2 mol／L NaOH进行中和，沉淀又出现。
继续滴加沉淀又逐渐消失。
观察此时溶液的颜色变化。
2. 酪蛋白等电点的测定（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5％酪蛋白l ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。
五、结果处理用一、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示各管的混浊度。
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实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定
一、目的和要求
1.了解蛋白质的两性解离性质。
2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。
二、原理
蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。
当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
三、试剂和器材
1.试剂
0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸；
0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液
2.器材
试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml）
四、操作方法
1.蛋白质的两性反应
（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。
观察溶液呈观的颜色，并说明原因。
（2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH接近与酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。
（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。
继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何
变化？说明了什么问题？
2.酪蛋白等电点的测定
（1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。
加入每种试剂后应混合均匀。
（2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。
根据观察结果，指出哪一个PH是酪蛋白的
等电点？
（3）该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。
五、思考题
1.在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的
胶体性质加以说明。
2.在本试验中，酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，所以说凡是蛋白
质在等电点时必然沉淀出来。
上面这种结论对吗？为什么？请举说明。