实验一 蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]
蛋白质的两性反应实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质的两性反应特性。
2. 掌握蛋白质在酸碱环境中的电荷变化及其对溶解度的影响。
3. 学习通过实验观察蛋白质在不同pH值条件下的沉淀现象，并确定其等电点。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的高分子化合物，分子中包含有氨基（-NH2）和羧基（-COOH）等基团。
这些基团在不同pH值条件下可以解离，从而使得蛋白质分子带正电荷或负电荷。
蛋白质的这种性质称为两性反应。
当蛋白质溶液的pH值等于其等电点时，蛋白质分子所带的正负电荷相等，此时蛋白质的溶解度最低，容易形成沉淀。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、蒸馏水、pH试纸、滴管、试管等。
2. 试剂：1mol/L HCl、1mol/L NaOH、1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）、1mol/L硼砂缓冲液（pH 8.5）、1mol/L醋酸缓冲液（pH 4.5）。
四、实验步骤1. 将鸡蛋清用蒸馏水稀释至一定浓度。
2. 分别取适量稀释后的鸡蛋清溶液于试管中。
3. 使用pH试纸测定稀释后的鸡蛋清溶液的pH值。
4. 将1mol/L HCl逐滴加入鸡蛋清溶液中，观察并记录溶液pH值的变化及蛋白质沉淀现象。
5. 重复步骤4，使用1mol/L NaOH、1mol/L Tris-HCl缓冲液、1mol/L硼砂缓冲液和1mol/L醋酸缓冲液分别调节鸡蛋清溶液的pH值，观察并记录溶液pH值的变化及蛋白质沉淀现象。
6. 通过对比不同pH值条件下的蛋白质沉淀现象，确定鸡蛋清溶液的等电点。
五、实验结果与分析1. 在pH 4.5时，鸡蛋清溶液开始出现沉淀，随着pH值的降低，沉淀逐渐增多。
2. 当pH值达到2.5时，沉淀量达到最大，此时蛋白质所带的正负电荷相等，为等电点。
3. 随着pH值的升高，沉淀逐渐减少，当pH值达到8.5时，沉淀基本消失。
六、实验结论1. 蛋白质具有两性反应特性，在不同pH值条件下，其电荷和溶解度发生变化。
2. 通过实验观察蛋白质在不同pH值条件下的沉淀现象，可以确定其等电点。
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质的两性性质及等电点的测定一 实验目的通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。
因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
HRCOOHNH 3+HRCOONH 3+HRCOO H 2NOH在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。
在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。
而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。
所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。
若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。
如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。
本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备(1) 试管架 1个(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支四 实验试剂（1）1mol/L 醋酸溶液：量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL ，加水至50 mL 。
（2）0.1mol/L 醋酸溶液：量取1mol/L 醋酸5 mL ，加水至50 mL 。
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。
根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。
不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。
一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。
在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。
2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。
该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。
IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。
其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。
将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。
加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。
每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。
将记录的数据制成曲线图。
由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。
将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。
（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。
b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
1．蛋白质的等电点测定.doc
课程：基础生物化学实验学院：班级：学号：姓名：成绩：评阅教师：实验一蛋白质的等电点和含量测定1．蛋白质的等电点测定（pH值沉淀法）一、实验目的1．学习和掌握蛋白质的两性解离性质。
2．掌握pH值法测定蛋白质等电点的一般原理和操作方法。
二、实验原理三、试剂与仪器、耗材1．试剂2．仪器耗材四、实验方法取4支同样规格的试管，按下表顺序分别精确地加入各试剂，加入后立即混匀，加一管，摇匀一管。
静置，观察各管在不同时间的混浊度。
观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。
表1试剂管号H2O/mL0.01mol/LHAC/mL0.10mol/LHAC/mL1.00mol/LHAC/mLpH蛋白质溶液/mL观察现象0 min 10 min 20 min1234五、实验结果、计算与分析1.观察各管中清澈度变化，记录结果并解释现象.2.确定酪蛋白的等电点。
六、思考题蛋白质在等电点沉淀的原因是什么？影响该实验结果准确性的因素有哪些？2. 双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的1．学习双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。
2．学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的实验操作方法。
二、实验原理三、试剂与仪器、耗材1．试剂2．仪器耗材四、实验方法1.制标准曲线取试管6支，编号0-5，按下表顺序加入各试剂。
表2试管试剂/mL0 1 2 3 4 5标准牛血清白蛋白0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质含量 mg/mL 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0上述试剂加完后，充分混匀，室温放置30 min。
以0号管为对照管，于540 nm处比色测定吸光值，记下各管吸光度，以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，作吸光度-蛋白质含量标准曲线。
2．样品测定五、实验结果、计算与分析1．使用Excel程序绘制标准曲线，计算回归方程。
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定一、实验目的与要求1.掌握蛋白质的两性解离性质；2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。
虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。
因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。
调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。
在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。
三、实验材料、试剂与仪器1.材料与试剂NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。
0.5 %酪蛋白溶液：0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~8.5）；0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有0.57mL0.1mol/LNaOH的水中。
该指示剂的变色范围是：酸性（pH3.8）为黄色，pH5.4为蓝色；0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可；0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL；0.1 mol/L的乙酸溶液：将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。
实验一、蛋白质的等电点测定
三、试剂仪器和试剂
1、仪器设备
试管及试管架 滴管 吸量管 容量瓶
2、试剂
0.5% 酪蛋白溶液 0.01%溴甲基酚绿指示剂 0.10 mol/L 盐酸溶液 0.10 mol/L 氢氧化钠溶液 1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液
Ø 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品 和器材。
➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾 桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。 实验完毕，仪器洗净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使 用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设 备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
常用方法：利用溴甲酚绿指示剂的变色来 观察蛋白质的两性性质。
3.8
5.6
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离的 正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值为 该蛋白质的等电点。
微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌 和病毒感染的潜在危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须 用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。
被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。 被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。
5
试剂使用规则
Ø 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 Ø 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原
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一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、初步学会测定蛋白质等电点的方
Байду номын сангаас
法。
3、学会正确使用吸量管吸量试液。
二、实验原理
蛋白质分子除含有一定的自由氨基和羧基外， 还含有酚基、巯基、胍基、唑基等，因此，蛋白 质和氨基酸一样也有两性电离的性质。在溶液中， 蛋白质的解离状态受溶液酸碱度影响，酸性溶液 中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴 离子。等电点时，蛋白质分子所携带的正负电荷 相等，以兼性离子存在，在电场中不向正负电极 移动，在溶液中溶解度最小，容易沉淀析出。
剂 i ]
• 该实验要求各种试剂的浓度和加入量 必须相当准确。实验中应严格按照定 量分析的操作进行。
• 思
考
题
• 何谓蛋白质的等电点？ • 在等电点时蛋白质的溶解度为什么 最低？请结合你的实验结果和蛋白 质的胶体性质加以说明。
剂 i ]
1 3.2 0.8
剂 i ]
2 － －
4.0 － 1.0 4.1
3 2.0 －
2.0 － 1.0 4.4
4 3.0 －
1.0 － 1.0 4.7
5 3.5 －
0.5 － 1.0 5.0
6 1.5 －
－ 2.5 1.0 5.3
7 2.75 －
－ 1.25 1.0 5.6
－ －
1.0 3.8
• 2、静置约20分钟，观察每支试管中溶 液的混浊度，以一，十，十十，十十 十，十十十十符号表示沉淀的多少。 根据观察结果指出哪一个pH是酪蛋白 的等电点？
（6）0.01 mol/L醋酸溶液。 （8）0.02 mol/L氢氧化钠溶
• （3）0.01％溴甲酚绿指示剂。（4）0.02 mol/L盐酸溶液。 • （5）0.10 mol/L醋酸溶液。 • （7）1.00 mol/L的醋酸溶液 液。
2、仪器 （1）恒温水浴箱 （2）温度计 （3）100 mL容量瓶 （4）50 mL容量瓶 （5）吸量管 （6）试管 （7）试管架等
不同的蛋白质等电点不同，可利用溶解度来 测定其等电点。向各种不同pH值的缓冲溶液中加 入酪蛋白，以沉淀出现最多的缓冲液的pH值为酪 蛋白的等电点。
等电点时，蛋白质以兼性离子存在，容易沉淀析出。
三、试剂和器材
1、试剂
• （1）0.5%酪蛋白溶液
•
（2）酪蛋白乙酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水 20毫升及1.00 mol/L氢氧化钠溶液5毫升(必须准确)，摇荡使 酪蛋白溶解。然后加1.00 mol/L醋酸5毫升(必须准确)，倒人 50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋 白溶于0.10 mol/L乙酸钠溶液中，酪蛋白的浓度为0.5%。
剂 i ]
四、操作方法
• （一）蛋白质的两性反应
•
•
1、取1支试管，加0.5％酪蛋白溶液20滴和0.01%溴甲酚绿指 示剂5—7滴，混匀。观察溶液呈现的颜色，并说明原因。
2、用细滴管缓慢加入0.02 mol/L盐酸溶液，随滴随摇，直至 有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH按近于酪蛋白的等电点。 观察溶液颜色的变化。 3、继续滴入0.02 mol/L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变 化．并说明原因。 4、再滴入0.02 mol/L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现 沉淀，解释其原因。继续滴入0.02 mol/L氢氧化钠溶液，为什么 沉淀又会溶解？溶液的颜色如何变化? 说明了什么问题？
剂 i ]
• •
（二）酪蛋白等电点的测定 1、取7支粗细相近的干燥试管， 编号后按下表的顺序准确地加入各 种试剂。加入每种试剂后应混合均
剂 i ]
匀。
试 管 编 号 蒸馏水 1.00 mol/L 加 醋酸 入 0.10 mol/L 试 醋酸 剂 (ml 0.01 mol/L 醋酸 ) 酪蛋白乙酸 钠 溶液最终pH 沉淀出现情况