实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应(精)
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管号 1 2
3
操作 振荡混匀 加数滴盐酸 振荡混匀 醋酸中和 加数滴盐酸 振荡混匀 碳酸钠中和 加数滴盐酸
现象
解释
思考题
1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 3.什么是蛋白质的等电点？ 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生
沉淀 ？
• 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测 定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸 钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的 等电点。
• 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成 水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体 颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白 质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变， 蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂 中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液 稳定的条件仍然存在（如电荷），并不 析出。因此变性蛋白质并不一定都表现 为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变 性。
蛋白质的沉淀反应可分为 两类。
可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变 化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天 然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析 作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间 作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此 类反应。
不可逆沉淀反应
实验二、蛋白质 等电点测定及沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定
实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定一、目的和要求1.了解蛋白质的两性解离性质。
2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。
二、原理蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。
当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
三、试剂和器材1.试剂0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸；0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液2.器材试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml）四、操作方法1.蛋白质的两性反应（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。
观察溶液呈观的颜色，并说明原因。
（2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。
（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。
继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？2.酪蛋白等电点的测定（1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。
加入每种试剂后应混合均匀。
试管编号9蒸馏水（ml）2.43.2—1.60.8———2.03.03.51.52.753.38————————加1N醋酸溶液入0.1N醋酸溶液—的0.01N醋酸溶液—试酪蛋白醋酸钠剂溶液最终PH沉淀出现情况4.02.01.00.5—————2.51.250.621.01.01.01.01.01.01.01.01.03.53.84.14.44.75.05.35.65.9（2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。
实验二蛋白质的两性反应与等电点测定24页PPT
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
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11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
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蛋白质的两性电离及等电点
蛋⽩质的两性电离及等电点
（⼀）两性电离
蛋⽩质既含有能解离成带正电荷的氨基，⼜含有能解离成带负电荷的羧基，可以进⾏两性电离。
蛋⽩质在溶液中的游离状态受溶液pH值的影响，在酸性环境中，蛋⽩质分⼦电离成阳离⼦，在碱性环境中，则电离成阴离⼦，蛋⽩质在某⼀pH值的溶液中所带正、负电荷的量相等时，被称为兼性离⼦（两性离⼦）。
（⼆）等电点（pI）
蛋⽩质以兼性离⼦状态存在时溶液的pH值即为该蛋⽩质的等电点。
⾎浆的pH为7.4.⽽⾎浆中各种蛋⽩质的等电点都⼩于7.4.故在⾎浆中以阴离⼦形式存在。
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（三）电泳
蛋⽩质阴、阳离⼦在电场中分别向正、负电极移动。
这种带电荷的蛋⽩质，在电场中向电性相反的电极移动的现象称为蛋⽩质电泳。
电泳的速度与带电粒⼦电荷多少、分⼦的⼤⼩、形状以及电场强度等多种因素有关，故可⽤电泳法来分离纯化、鉴定和制备蛋⽩质。
蛋白质等电点的测定实验报告
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。
2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。
3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。
当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。
本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。
醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。
在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。
用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。
2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。
3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。
在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。
接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。
4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。
取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。
5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。
蛋白质的性质实验(二)——蛋白质的等电点测定和沉淀反应
六、实验思考
何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？ 详细记录各实验的结果和现象，并解释这些现象。
（2）不可逆的沉淀反应：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质 常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝 固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应 注意：蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电 荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀 的蛋白质也未必都已变性 沉淀蛋白质的方法 盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如硫酸铵，硫酸钠或氯 化钠），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐的浓度不同，析出的蛋 白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在 饱和硫酸铵溶液中析出。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性，当除去盐 后，即可溶解 重金属盐沉淀法：当溶液pH大于蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带负电 荷，容易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+或Ag+）结合成不溶性盐而 沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救 就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再用催吐剂排出体外
某些有机酸沉淀法：某些有机酸指的是三氯乙酸、磺基水杨酸和硝酸 等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与酸类的酸 根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀 有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、 乙醇或丙酮），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数，致使蛋 白质颗粒容易凝集而沉淀。此法如果控制在低温下操作并且缩短处理 时间，则可使变性速度减慢 加热变性沉淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类 促进蛋白质加热凝固，当蛋白质处于等电点时，加热变性凝固最完全 和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使 蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋 白质处于等电点，也破坏了带电状态。古代人将大豆蛋白质的浓溶液 加热并点入大量盐卤（含MgCl2）制豆腐，便是此方法的成功应用
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生物化学与分子生物学实验
结论 1：
蛋白质是两性电解质 pH= pI时，蛋白质溶解度最小
酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4之间
生物化学与分子生物学实验
酪蛋白等电点的测定
取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂
试管号码 蒸馏水 1.00M醋酸 0.1M醋酸 0.01M醋酸 pH 1 2 3 4 5 6 7 2.4 3.2 — 3.0 1.5 2.75 3.38 — — 1.6 0.8 — — — — — 4.0 1.0 — — — — — — — 2.5 1.25 0.62 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9
pH>pI
阳离子
兼性离子
阴离子
生物化学与分子生物学实验
维持蛋白质胶体稳定的因素： 表面电荷、水化膜
在等电点时蛋白质颗粒上的净电
荷为零，缺乏同电相斥的因素，蛋
白质溶解度最小，最容易析出沉淀
生物化学与分子生物学实验
本实验配制了各种不同 pH 值的
缓冲液，沉淀出现最多的缓冲液 pH值即为酪蛋白的等电点
生物化学与分子生物学实验
实
验
二
蛋白质的两性反应与 等电点测定
生物化学与分子生物学实验
实验目的
了解蛋白质的两性解离性质 掌握测定蛋白质等电点的方法
生物化学与分子生物学实验
实验原理
P COOH NH2
+OH+H+
P
COOH NH3+
pH<pI
+OH+H+
P
COONH3+ pH=pI
P
COONH2
1
沉淀量
2 +
3 +++
4 ++++
5 ++
6 0
7 0
0
生物化学与分子生物学实验
结论 2：
4号试管沉淀量最多
说明4号管溶液的pH值为酪蛋
白的等电点，即pI=4.7
生物化学与分子生物学实验
思考题
什么是蛋白质的等电点？ 在等电点时，蛋白质溶液为什 么容易发生沉淀？
生物化学与分子生物学实验
实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题
生物化学与分子生物学实验
预 习
实验三
凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高
铁氰化钾
注：单位均为mL
生物化学与分子生物学实验
向每个试管中各加 0.5%酪蛋白溶液20滴， 加一管，立即混匀一管 静置30分钟后，以0、+、++、+++、++++ 表示各管的混浊度，并指出哪一种pH是酪蛋 白的等电点
生物化学与分子生物学实验
实验结果
酪蛋白等电点的测定
1 2 3 4 5 6 7
实验步骤
蛋白质的两性反应（1）
取一干净试管
酪蛋白液10滴
溴甲酚绿指示剂3滴
观察溶液颜色 并解释现象
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的两性反应（2）
滴加0.02M HCL溶液
边滴加边混匀
有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 继续滴加0.02M HCL溶液
边滴加边混匀
至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象
生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的两性反应(3)
[OH-] ，沉淀 出现最大量沉淀时,说 明到达了酪蛋白的等电点 溶液由黄色变成浅绿色 （3.8﹤pH﹤5.4）
生物化学与分子生物学实验
继续加碱，[OH-]继续 增大，pH﹥pI。酪蛋白所
带负电荷不断增加，同电
相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶 液显蓝色(pH﹥5.4)
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的两性反应(2)
[H+] ，沉淀 出现最大量沉淀时,说 明到达了酪蛋白的等电点 溶液由蓝色变成浅绿色 （3.8﹤pH﹤5.4）
生物化学与分子生物学实验
继续加酸，[H+]继续增 大，pH＜pI。酪蛋白所带
正电荷不断增加，同电相
斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解时，溶 液显黄色(pH﹤3.8)
生物化学与分子生物学实验
实验器材与试剂
大试管、滴管、刻度吸量管
0.5％酪蛋白醋酸钠溶液 0.01％溴甲酚绿指示剂(指示范围: pH3.8-5.4)
0.02M HCL溶液、 0.02M NaOH溶液
0.01M醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、 1.00M醋酸溶液
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的两性反应（3）
继续滴加0.02M NaOH溶液
边滴加边混匀
有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 继续滴加0.02M NaOH溶液
边滴加边混匀
至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象
生物化学与分子生物学实验
实验结果
蛋白质的两性反应(1)
溶液呈蓝色 酪蛋白溶液呈碱性 (pH﹥5.4)，使溴甲酚 绿指示剂显蓝色