实验一 蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定

实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定

一、实验目的与要求

1.掌握蛋白质的两性解离性质；

2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。

二、实验原理

蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。

在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。

三、实验材料、试剂与仪器

1.材料与试剂

NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。

0.5 %酪蛋白溶液：

0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入

0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~

8.5）；

0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有

0.57mL

0.1mol/LNaOH的水中。该指示剂的变色范围是：

酸性（pH

3.8）为黄色，pH

5.4为蓝色；

0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可；

0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL；

0.1 mol/L的乙酸溶液：

将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；

0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；

1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。

2.仪器

试管、滴管、移液管、pH试纸等。

四、实验方法与步骤

1.蛋白质的两性反应

1）取一支干净的试管，加入20滴

0.5 %的酪蛋白溶液，逐滴加入

0.01 %的溴甲酚绿溶液（约5~7滴），充分混合，观察溶液的颜色并解释（蓝色）。

2）逐滴加入

0.02 mol/L的HCl，随加随摇动试管，直到出现明显的沉淀为止，用精密pH 试纸测溶液的pH，观察溶液的颜色变化。

3）继续加入

0.02 mol/L的HCl，观察沉淀的变化和溶液颜色的变化。

4）逐滴加入

0.02 mol/L的NaOH到上面的溶液中，使溶液的pH接近中性，观察沉淀是否形成。

5）继续滴加

0.02 mol/L的NaOH，观察沉淀的变化。

2.酪蛋白等电点的测定

1）取9只试管分别编号1~

9.

2）按下表向每管中加入试剂。注意，每种试剂加完后，要振荡试管。

3）试剂全部加完后，静置20 min。

4）观察每管内溶液的混浊度，用“+”、“-”表示沉淀的多少。

5）判断酪蛋白的pI是多少？

试管号9水/mL

2.4

3.2—

2.0

3.0

3.5

1.5

2.75

3.381 mol/L

HAc/mL

1.6

0.8———————0.1mol/L HAc/mL——

4.0

2.0

1.0

0.5———0.01 mol/L酪蛋白醋酸HAc/mL——————

2.5

1.25

0.62钠溶液/mL

1溶液最终的

pH

3.5

3.8

4.1

4.4

4.7

5.0

5.3

5.6

5.9沉淀多少

五、思考题

1.何谓蛋白质的等电点？在等电点时蛋白质的溶解度最低，为什么？

2.本实验中，根据蛋白质的何种性质测定其等电点？

3.测定蛋白质等电点为什么应在缓冲液中进行？