实验一 蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应
酸溶液及0.05 M碳酸钠溶液中和。观察颜
色的变化和沉淀的生成。
每管再加0.1 M盐酸溶液数滴，观察沉淀
的再溶解。
解释各管发生的全部现象。
提示：卵清蛋 白等电点4.7
五、实验结果与报告
实验结果与分析：
按照实验报告要求记录实验结果并分析。
研讨： 通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。 解释盐析、有机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀 蛋白质的不同机理。 查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。 查阅资料，介绍生物大分子制备常用的沉淀方法。 蛋白质变性有哪些方面的应用？ 大组总结交流（PPT）： 内容：实验结果与分析，课后研讨题，实验体会等。
加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为
5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟
后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一
管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质沉淀实验
1. 蛋白质的盐析
加5%卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量 饱和硫酸铵溶取3支试管，编号，依下表顺序加入试剂：
试剂 5%卵 0.1 M 0.1 M pH4.7 95%乙 mL 清蛋白 氢氧化 盐酸 缓冲液 醇 钠 管号 1 1 1 1 2 3 1 1 1 1 1 1
振摇混匀后，观察各管有何变化。
放置片刻，向各管内加水8 mL。在2、3
号管中各加一滴甲基红，分别用0.1 M醋
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离 的正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值 为该蛋白质的等电点。 不同蛋白质具有各自特定的等电点，与该蛋白 质的组成结构有关。 在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可 利用性质的变化测定各种蛋白质的等电点。 常用方法：测其溶解度最低时的溶液pH值。
酪蛋白等电点的测定实验报告
酪蛋白等电点的测定实验报告一、实验目的1、掌握测定酪蛋白等电点的原理和方法。
2、熟悉使用酸度计测量溶液 pH 值的操作。
3、加深对蛋白质两性解离性质的理解。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的 pH 条件下，其解离成正离子和负离子的程度相等，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。
当溶液的 pH 低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷；当溶液的 pH 高于蛋白质的等电点时，蛋白质带负电荷。
酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质之一，其等电点约为 47。
在等电点时，酪蛋白溶解度最小，容易沉淀析出。
本实验通过调节溶液的 pH 值，观察酪蛋白的沉淀情况，从而确定其等电点。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜牛奶、01mol/L 盐酸、01mol/L 氢氧化钠、1%乙酸、95%乙醇。
2、仪器酸度计、离心机、玻璃棒、烧杯（50ml、100ml）、量筒（10ml、50ml）、移液管（1ml、5ml）、滴管、pH 试纸。
四、实验步骤1、制备酪蛋白粗提液（1）取新鲜牛奶 20ml 于 100ml 烧杯中，加热至 40℃，边搅拌边慢慢加入 10ml 1%乙酸，使牛奶中的酪蛋白沉淀。
（2）用四层纱布过滤上述混合液，收集沉淀，用少量蒸馏水洗涤沉淀 2-3 次，以除去其中的水溶性杂质。
（3）将沉淀转移至50ml 烧杯中，加入20ml 95%乙醇，搅拌均匀，静置 5 分钟，使酪蛋白充分沉淀。
（4）用离心机以 3000r/min 离心 5 分钟，弃去上清液，得到酪蛋白沉淀。
2、测定酪蛋白等电点（1）将上述沉淀用少量蒸馏水溶解，转移至 50ml 容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得到酪蛋白溶液。
（2）用移液管吸取 1ml 酪蛋白溶液于 50ml 小烧杯中，加入 40ml蒸馏水，用酸度计测量溶液的初始 pH 值。
（3）用滴管逐滴加入01mol/L 盐酸溶液，同时搅拌，每次加05ml，加完后用酸度计测量溶液的 pH 值，直至溶液出现混浊，记录此时的pH 值。
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定一、实验目的与要求1.掌握蛋白质的两性解离性质；2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。
虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。
因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。
调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。
在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。
三、实验材料、试剂与仪器1.材料与试剂NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。
0.5 %酪蛋白溶液：0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~8.5）；0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有0.57mL0.1mol/LNaOH的水中。
该指示剂的变色范围是：酸性（pH3.8）为黄色，pH5.4为蓝色；0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可；0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL；0.1 mol/L的乙酸溶液：将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。
实验1：蛋白质的两性电离和等电点-文档资料
蓝
【实践操作】1.取洁净大试管1支，按表如下操作
操 作 步 骤
加入5g/L酪蛋白乙酸钠溶液20 滴，BCG指示剂5滴，混匀后， 观察并记录溶液的颜色。 缓慢滴加0.04mol/L盐酸溶液， 边滴边摇，直至产生明显的大量 沉淀，观察并记录沉淀与溶液颜 色的变化。
结
果
结 果 分 析
颜色 滴数 颜色
继续滴入0.04mol/L盐酸溶液， 直至沉淀全部溶解，观察并记录 沉淀与溶液颜色的变化。
【试剂】
1. 5g/L酪蛋白乙酸钠溶液 2. 0.01%溴甲酚绿（BCG）溶液（指示剂， pH3.8—5.4 pH3.8—5.4） 黄 3. 0.04 mol/L盐酸溶液 4. 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液 5. 1.0 mol/L乙酸溶液 6. 0.1 mol/L乙酸溶液 7. 0.01mol/L乙酸溶液 【器材】 试管 试管架 毛滴管 记号笔
沉淀结果用“-，+，++，+++”表示并记录于表中。
【注意事项】 冒用他人结果，两人成绩全部取消，并加倍扣分。
1.沉淀符号，“－”表示无沉淀，“＋”表示浑浊无明显沉淀，“＋＋” 有明显沉淀，有小颗粒；“＋＋＋”表示大块沉淀。 2.四人共用一组试剂，在本座位，依次轮流添加，不可四处走动。 3.每组派一名代表到前面取一小试管蒸馏水，本组共用。 4.添加各种试剂注意用相应的毛滴管，不可混用！！ 5.注意混匀试管，实验1中添加盐酸和氢氧化钠时注意边添加边震荡试管， 接近PI时逐滴添加，沉淀消失后停止添加试剂，在结果一栏记入添加试剂 的滴数。
6.实验1出现明显沉淀，请老师检查后在实验报告上并签字确认 （应两次出现沉淀）。
7.实验2出现结果后请老师检查确认后给予实验成绩。
实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定
实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定【目的】验证蛋白质的两性电离与等电点性质。
【原理】蛋白质由氨基酸组成。
蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外，其侧链上的某些酸性基团或碱性基团，在一定的溶液pH 条件下，都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。
因此，蛋白质具有两性解离性质。
当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等，既净电荷为零，成为兼性离子，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点（isoelectric point,pI ）。
蛋白质在等电点状态时溶解度最低，容易沉淀析出。
蛋白质在大于其等电点的pH 值溶液中带负电荷；在小于其等电点的pH 值溶液中则带正电荷。
蛋白质在等点电以外的pH 值溶液中，因分子带有同种电荷而相互排斥，不易沉淀。
本实验通过观察酪蛋白在不同pH 溶液中的溶解度来测定其等电点。
＞pI （pH ）pI （pH ）=pI ＜（pH ）PrNH 3+COO -PrNH 3+COOHPrNH 2COO -蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子【操作】1. 蛋白质的两性电离取试管1支，按以下步骤加入各种试剂，观察现象变化并记录。
.；. 2. 酪蛋白等电点的测定取试管5支，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂并混匀。
静置室温20分钟后观察各管沉淀出现情况，并以－，＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋符号记录沉淀的多少。
【思考题】1．为什么说蛋白质是两性电离电解质，何谓蛋白质的等电点？2. 在等电点状态下，为什么蛋白质容易发生沉淀？3. 本实验中酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，由此得出蛋白质在等电点时必然沉淀，此结论对吗，为什么？。
实验一、蛋白质的等电点测定
三、试剂仪器和试剂
1、仪器设备
试管及试管架 滴管 吸量管 容量瓶
2、试剂
0.5% 酪蛋白溶液 0.01%溴甲基酚绿指示剂 0.10 mol/L 盐酸溶液 0.10 mol/L 氢氧化钠溶液 1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液
Ø 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品 和器材。
➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾 桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。 实验完毕，仪器洗净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使 用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设 备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
常用方法：利用溴甲酚绿指示剂的变色来 观察蛋白质的两性性质。
3.8
5.6
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离的 正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值为 该蛋白质的等电点。
微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌 和病毒感染的潜在危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须 用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。
被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。 被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。
5
试剂使用规则
Ø 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 Ø 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原
生物化学实验讲义——生工10
实验一 蛋白质的两性性质及等电点的测定一 实验目的通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。
因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
RNH 3+RCOONH 3+RCOO H 2NOHOH在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。
在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。
而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。
所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。
若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。
如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。
本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备(1) 试管架 1个(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支四 实验试剂（1）1mol/L 醋酸溶液：量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL ，加水至50 mL 。
（2）0.1mol/L 醋酸溶液：量取1mol/L 醋酸5 mL ，加水至50 mL 。
【优文档】实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定PPT
移动，在溶液中溶解度最小，容易沉淀析出。 00 mol/L醋酸5毫升(必须准确)，倒人50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.
00 mol/L氢氧化钠溶液5毫升(必须准确)，摇荡使酪蛋白溶解。
不同的蛋白质等电点不同，可利用溶解度来测 定其等电点。向各种不同pH值的缓冲溶液中加入 酪蛋白，以沉淀出现最多的缓冲液的pH值为酪蛋 白的等电点。
－
－
－
－
在溶液中，蛋白质的解离状态受溶液酸碱度影响，酸性溶液中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴离子。
入 （一）蛋白质的两性反应
0.10 mol/L 在溶液中，蛋白质的解离状态受溶液酸碱度影剂响，酸性溶液中蛋白质解离成阳离子，碱性溶液中则解离成阴离子。
试 － 4.0 2.0 1.0 0.5 － 00 mol/L的醋酸溶液 （8）0.
• 该实验要求各种试剂的浓度和加入量 必须相当准确。实验中应严格按照定 量分析的操作进行。
• 思考题
• 何谓蛋白剂质的等电点？ i
• 在等电点]时蛋白质的溶解度为什么 最低？请结合你的实验结果和蛋白 质的胶体性质加以说明。
酪钠蛋白乙酸 1.0 1.0 3、继续滴入0.
1.0
1.0
1.0
1.0
溶液最终pH 3.8 4.1 4.4 4.7 5.0 5.3
7 2.75 － －
1.25
1.0 5.6
沉淀出现情况
• 2、静置约20分钟，观察每支试管中 溶液的混浊度，以一，十，十十，十 十十，十十十十符号表示沉淀的多少。
剂
根据观察结i] 果指出哪一个pH是酪蛋白 的等电点？
蛋白质分子除含有一定的自由氨基和羧基外，还含有酚基、巯基、胍基、唑基等，因此，蛋白质和氨基酸一样也有两性电离的性质。
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实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
一、实验目的与要求
1.掌握蛋白质的两性解离性质；
2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
二、实验原理
蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。
虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。
因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。
调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。
在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。
三、实验材料、试剂与仪器
1.材料与试剂
NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。
0.5 %酪蛋白溶液：
0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入
0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~
8.5）；
0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有
0.57mL
0.1mol/LNaOH的水中。
该指示剂的变色范围是：
酸性（pH
3.8）为黄色，pH
5.4为蓝色；
0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可；
0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL；
0.1 mol/L的乙酸溶液：
将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；
0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；
1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。
2.仪器
试管、滴管、移液管、pH试纸等。
四、实验方法与步骤
1.蛋白质的两性反应
1）取一支干净的试管，加入20滴
0.5 %的酪蛋白溶液，逐滴加入
0.01 %的溴甲酚绿溶液（约5~7滴），充分混合，观察溶液的颜色并解释（蓝色）。
2）逐滴加入
0.02 mol/L的HCl，随加随摇动试管，直到出现明显的沉淀为止，用精密pH 试纸测溶液的pH，观察溶液的颜色变化。
3）继续加入
0.02 mol/L的HCl，观察沉淀的变化和溶液颜色的变化。
4）逐滴加入
0.02 mol/L的NaOH到上面的溶液中，使溶液的pH接近中性，观察沉淀是否形成。
5）继续滴加
0.02 mol/L的NaOH，观察沉淀的变化。
2.酪蛋白等电点的测定
1）取9只试管分别编号1~
9.
2）按下表向每管中加入试剂。
注意，每种试剂加完后，要振荡试管。
3）试剂全部加完后，静置20 min。
4）观察每管内溶液的混浊度，用“+”、“-”表示沉淀的多少。
5）判断酪蛋白的pI是多少？
试管号9水/mL
2.4
3.2—
2.0
3.0
3.5
1.5
2.75
3.381 mol/L
HAc/mL
1.6
0.8———————0.1mol/L HAc/mL——
4.0
2.0
1.0
0.5———0.01 mol/L酪蛋白醋酸HAc/mL——————
2.5
1.25
0.62钠溶液/mL
1溶液最终的
pH
3.5
3.8
4.1
4.4
4.7
5.0
5.3
5.6
5.9沉淀多少
五、思考题
1.何谓蛋白质的等电点？在等电点时蛋白质的溶解度最低，为什么？
2.本实验中，根据蛋白质的何种性质测定其等电点？
3.测定蛋白质等电点为什么应在缓冲液中进行？。