蛋白质的性质实验

实验一
蛋白质的性质实验
蛋白质及氨基酸的呈色反应
【实验目的】
1.加深理解所学有关的蛋白质性质的理论知 识
2.掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量分 析的方法及原理
一、蛋白质呈色反应
• 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸 •
•
及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生 了生成有色物质的反应。 不同蛋白质分子所含的氨基酸残基不完全相同， 因此所发生的成色反应也不完全一样。 呈色反应并不是蛋白质的专一反应。因此，不能 仅仅根据呈色反应的结果为阳性就来判断被测物 质一定是蛋白质，至少要用2种以上的方法来鉴 别。
双缩脲的制备 少许尿素结晶于干燥试管中
微火加热
注意：
• (1)尿素结晶不要取多，约火柴头大小。 • (2)在操作过程中试管不能冲向他人以防止
烫伤。 • (3)控制加热的时间既不能过长也不能过短。 • (4)加热时火不能太大，防止碳化。 • (5)铜离子不能多加，否则与氢氧化钠形成 蓝色的氢氧化铜，干扰试验结果。
【试剂】
1.蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20） 2.考马斯亮蓝染液
【实验流程】
• 取2支试管，按下表作
试剂 管号 1 2 蛋白质溶液 （mL） 0 0.1 蒸馏水（mL） 1 0.9 考马斯亮蓝 （mL） 2.5 2.5
实验结果如图所示：
2. 3. 4. 5. 6.
通过2-3层纱布滤去不溶物） 0.1%的甘氨酸溶液 0.01%精氨酸溶液 10%NaOH溶液 1%CuSO4溶液 尿素结晶
【实验流程】
尿素熔解至 硬化 停止加热 看到有白色气体 冷却 加10%氢氧化钠 溶液约1ml 震荡 震荡 观察颜色的变化 加入1%硫酸铜溶液2滴
如图所示
（一）双缩脲反应
【实验原理】 • 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素 脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。 其在碱性条件下双缩脲与铜离子结合成红 紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。其 反应过程如下：
H2N C H2N O + H2N H2N C O 180 C
0
O
O
H2NCNHCNH 2 + NH3
OH + HNO3 HO NO2 + H2O
OH HO NO2 + NaOH O N OH
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸， 所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝 化，需加少液（与双缩脲反应相同） 2.浓硝酸 3. 20%NaOH 4. 0.1%石炭酸溶液
（二）茚三酮反应
• 【实验原理】
在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸 与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此 反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨 基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)， 含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。
【试剂】
1.蛋白质样液（与双缩脲反应相同） 2. 0.1%的甘氨酸溶液 3. 0.2%茚三酮溶液
• 多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，
其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。 因此，在碱性条件下与铜离子也能呈现出 类似于双缩脲的呈色反应。其反应过程如 下：
H2N C H2N O + H2N H2N C O 180 C
0
O
O + NH3
H2NCNHCNH 2
【试剂】
1. 蛋白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，
【实验流程】
• 取试管2支，分别加入蛋白质样液及0．1％
甘氨酸溶液1ml，然后各加入茚三酮溶液 0.5ml，混匀后于沸水浴中加热数分钟，观 察颜色变化如图所示：
（三）黄色反应
• 【实验原理】
在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如 酪氨酸，色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作 用可生成黄色的硝基化合物，在碱性条件 下生成物可转变为桔黄色的硝醌衍生物,反 应为:
【实验流程】
1. 取0.1%石炭酸溶液约1ml放在试 管内，加浓硝酸5滴（注意不要弄 到手上），水浴加热，观察结果如 右图所示： 2. 取洁净试管1支，加蛋白质样液 1ml和浓硝酸5滴，出现沉淀，加热， 不必至沸腾，沸腾比较危险，则沉 淀变成黄色，待试管冷却后，向两 管各加20％NaOH溶液使成碱性， 观察颜色变化如图所示：
（四）考马斯亮蓝反应
• 【实验原理】
考马斯亮蓝具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶 液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质 通过疏水作用结合后变成为蓝色。它染色灵敏度 高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左 右时间达到平衡，在室一小时内稳定。在 0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与 A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。