生物化学实验--蛋白质性质试验
生物化学实验报告(实验五)
天津科技大学生物化学实验报告专业：班级：姓名学号组别第组实验项目同组人完成时间年月日【实验名称】《垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质》【实验目的】学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
【实验原理】蛋白质的性质：三种物理效应：、、。
1、2、3、成绩：教师签字：批阅日期：聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续：、、、。
1、2、3、4、蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：Mr=K(10-b·m)logMr=LogK—b·Rm式中Mr——蛋白质的分子量；logK——截距；b——斜率；Rm——相对迁移率。
实验证明，蛋白质分子量在15,000～200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。
蛋白质的相对迁移率Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。
这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。
【材料与设备】1.仪器设备DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂),电泳仪,微量移液器2.材料烧杯(250mL、500mL)、量筒(500mL、250mL)、培养皿3.主要试剂（1）标准蛋白混合液：内含磷酸化酶(Mw94,000)，牛血清蛋白(Mw67,000)，肌动蛋白(Mw43,000)，磷酸酐酶(Mw30,000)和溶菌酶(Mw14,000)（2）30％凝胶贮备液：Acr30g，Bis0.8g,加蒸馏水至100mL（3）分离胶缓冲液(1.5mol／L):Tris18.15g,加水溶解,6mol/L HCl调pH8.9,定容100mL（4）浓缩胶缓冲液(0.5mol／L):Tris6g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL（5）5×电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris6g，Gly28.8g，加水溶解并定容到1000mL。
实验二蛋白质的分离与鉴定
四、操作步骤
4.1 植物组织蛋白质提取方法 1）根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取 液，可根据材料不同适当加入），准备提 取液放在冰上。 2）把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后 加入提取液中在冰上静置（2-3小时）。 3）用离心机离心8000rpm 40min 4℃ 或 11100rpm 20min 4℃ 4）提取上清液，样品制备完成。
生物技术综合实验
实验二 蛋白质的分离与鉴定
一、目的和要求
1、掌握细胞蛋白质分 离的方法。 2、了解蛋白质的性质。
二、实验原理
1.
蛋白质的提取与纯化
蛋白质是两性电解质，在不同的pH条 件下所带电荷不同。在一定的电场条件下 蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向 移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷 的 数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动 的越远。
通过本试验，熟悉蛋白质的提取及检测 方法，尤其可以结合生物化学的方法进行 定性检测。
七、思考题，完成实验报告
1．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲
反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出 什么结论? 2．能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的主要试剂 1、 蛋白质提取液：300mL （1） 1M Tris-HCl（PH8）45mL （2）甘油（Glycerol）75mL （3）聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 2、 10%NaOH溶液。 3、 1％CuSO4。 4、考马斯亮蓝染液300mL
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子
脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得 到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类 化合物都有双缩脲反应。
食品生物化学实验课件(共38单元)14 实验十四 蛋白质的性质实验 (二) ———蛋白质沉淀反应
FOOD BIOCHEMISTRY EXPERIMENT
实验十四
蛋白质的性质实验 （二） ———蛋白质沉淀反应
一、实验目的
（１） 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 （２） 了解蛋白质变性与沉淀的关系。 （３） 学习沉淀蛋白质的几种方法。
二、 实验原理
水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳 定的亲水胶 体颗粒， 在一定理化因素影响下蛋白质颗粒可因失去 电荷和脱水而沉淀。 蛋白 质的沉淀反应可分为以下两类。
四、 实验内容
２.重金属离子沉淀蛋白质 向试管内加入 ２ｍＬ ５０ｇ ／ Ｌ 卵清蛋白溶 液， 然后加入 １ ～ ２ 滴 ３０ｇ ／ Ｌ 硝酸银溶液， 观察沉淀析出。 放置片刻 倾出上清液， 向沉淀中加一定量的水， 观察沉淀是否溶解？ 为什么？
３.有机酸沉淀蛋白质 向试管内加入２ｍＬ ５０ｇ ／ Ｌ 卵清蛋白溶液， 然后加入 １ｍＬ ５０ｇ ／ Ｌ 三氯乙酸溶液， 混匀， 观察沉淀的生成。 放置片 刻倾出上清液， 向沉淀中加一定量的水， 观察沉淀是否溶解？ 为什么？
三、 器材与试剂
１.器材 离心机。 ２.试剂 （ＮＨ４）２ＳＯ４结晶粉末， （ＮＨ４）２ＳＯ４饱和溶液， ５０ｇ ／ Ｌ 卵清蛋白溶液， ３０ｇ ／ Ｌ 硝 酸银溶液， ５０ｇ ／ Ｌ 三氯乙酸溶液， ９５％乙醇。
四、 实验内容
１.盐析 向试管内加入 ５ｍＬ ５０ｇ ／ Ｌ 卵清蛋白溶液， 然 后加入等量的 （ＮＨ４）２ＳＯ４饱和 溶液， 混匀后静置数分钟， 观 察球蛋白的析出。 取少量混浊液， 加入一定量水，观察沉淀是否溶解 ？ 将试管内溶液过滤， 向滤液中加（ＮＨ４）２ＳＯ４结晶粉末直到 不能溶解为止， 观察清蛋白的析出。 放置片刻倾出上清液， 向沉淀 中加一定量的水， 观察沉淀是否溶解？ 为什么？
生物化学实验--蛋白质性质试验
（三）黄色反应 原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如
酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物 质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物 硝醌酸等。
操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加 热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液 1ml，颜色有什么变化？
（四）茚三酮反应 原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三
操作：
1、尿素实验
取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其
熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，
至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然
后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1% 混匀，观察有无紫色出现。
CuSO4溶液，
2、蛋白液实验
取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4 滴1% CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
荧光法gml不同种类蛋白最大吸收波长nm标准方法准确操作麻烦费时灵敏度低适用于标准的测定紫外分光光度280205灵敏快速不消耗样品核酸类物质有影响100010000540重复性线性关系好灵敏度低测定范围窄样品需要量大folin酚试剂750灵敏费时较长干扰物质多25050500595灵敏度高稳定误差较大颜色会转移bca50500562灵敏度高稳定干扰因素少费时较长蛋白质不同方法比较一实验原理一实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸在碱性条件下可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色生成钼蓝和钨蓝化合物
察结果。 （四）生物碱试剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白液2ml及醋 酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，
观察现象。
http://222.195.234.199/openclass 登录名：自己的学号 密码：自己的学号 大家先把电子版的实验报告作好，然后在
生物化学实验
实验一、甲醛滴定法测定氨基氮一、 实验目的：初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、 实验原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：对溶液氨基酸含量的测定主要依据平衡中电离H +的浓度来确定。
因此，反应平衡应向右进行。
平衡向右的促进方式：1）增加底物的浓度——A 、增加AA 的浓度（本实验目的是测定氨基酸的含量，必须保证固定的氨基酸浓度；B 、加碱，让H +电离。
但—NH 3+ 是弱酸，完全解离时pH 为11~12或更高，若用碱滴定—NH 3+所释放的H + 不测量氨基酸，一般指示剂色域小于10，很难准确指示终点。
因此，直接用碱滴定是不可行的。
2）降低产物的浓度——在本实验中用加入过量甲醛的方式：常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使平衡右移，促使—NH 3+释放H +，使溶液的酸度增加，同时也使滴定终点从强碱区域（pH11~12）移至弱碱区域（pH9.0左右）。
而这一区域正好是酚酞的敏感变色区域(pH8~10)。
因此，可用酚酞用指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定（刚好微红）。
由滴定所用的NaOH 量就可计算出溶液中氨基酸的含量，这就称氨基酸的甲醛滴定法。
如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。
当然，如样品是蛋白质水解液，（实际上是多种氨基酸的混合物），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。
但是，基本规律如下：当蛋白质水解时，放出游离的氨基，随着水解程度的增加，滴定值也增加。
当滴定值不再增加，表示水解作用已完全。
相反，蛋白质合成时游离氨基减少。
因此，可以用此法测定溶液中的氨基量，就能大体判断出蛋白质水解或合成的进度。
二羟甲基氨基酸三、实验器材1、25ml锥形瓶2、微量滴定管3、吸管4、移液管四、实验试剂1、0.1mol/L标准甘氨酸溶液300ml准确称取750mg甘氨酸，溶解后定容至100ml。
2、0.1mol/L 标准氢氧化钠溶液500ml3、酚酞指示剂20ml0.5%酚酞的50%乙醇溶液4、中性醛溶液400ml在50ml 36%~37% 分析纯甲醛溶液中加入1mL 0.1% 酚酞乙醇水溶液，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。
生物化学实验
3.用白明胶（也是一种蛋白）做上述实验，结果如何？
（二）双缩尿反应
1.取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩尿，释出之氨可用红色石蕊试纸检测。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml摇匀，再加2滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。
6.尿素：如颗粒较粗，最好研成细粉末状。
7. 10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。
8.浓硝酸：比重1.42
9. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。
10.硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎。
11.饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml，加硫酸铵至饱和。
12. 95%乙醇
纱布过滤，滤液备用。
主要内容
1.过氧化氢酶实验：
取试管4支，按下表加入试剂：
管号
2%H2O2
（ml）
新鲜猪肝糜
（g）
煮熟肝糜
（g）
生马铃薯
（g）
熟马铃薯
（g）
1
2
3
4
3
3
3
3
0.5
－
－
－
－
0.5
－
－
－
－
1
－
－
－ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
－
1
加完，观察有无气泡产生，特别注意肝糜周围和马铃薯周围。
2.过氧化物酶实验：
取试管4支，按下表编号加入试剂：
取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀，观察有无沉淀析出。
生物化学实验2
《生物化学实验》教学方案湖南文理学院生命科学学院学院生化与分子生物学教研组实验一蛋白质的性质实验（ 1 ）—蛋白质和氨基酸的呈色反应授课题目：蛋白质的性质实验（ 1 ）——蛋白质和氨基酸的呈色反应（ 3 学时）授课对象：生科、农学、动科专业授课教师：教学目标及基本要求：1 、了解蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2 、了解某些蛋白质和氨基酸的呈色反应原理。
3 、学习几种常见的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
教学内容提要及时间分配：1 、实验原理讲解： 12 分钟双缩脲反应的原理茚三酮反应的原理黄色反应的原理坂口反应的原理考马斯亮蓝反应的原理2 、实验试剂与器材 2 分钟3 、实验步骤讲解： 10 分钟4 、总结。
2 分钟教学重点及难点：1 、双缩脲反应的原理。
2 、蛋白质、氨基酸与水合茚三酮的显色反应。
教学方法：采用启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体…等）：采用板书等手段进行教学。
使用的教材及参考资料：1 、生物化学实验指导，自编讲义。
2 、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版， 2003 年。
思考题：1 、如果蛋白质水解后双缩脲反应呈阴性时，可以对水解反应程度作出什么样的推论？2 、茚三酮反应的阳性结果为何颜色？能否用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质的存在？3 、考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理是什么？4 、如何正确使用分光光度计？5 、测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理有哪些不同？本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）1 、结合理论内容讲述实验内容，效果较好。
2 、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
实验二蛋白质的性质实验（ 2 ）—蛋白质等电点的测定和沉淀反应授课题目：蛋白质的性质实验（ 2 ）——蛋白质等电点的测定和沉淀反应（ 3 学时）授课对象：生科、农学、动科专业授课教师：教学目标及基本要求：1 、了解蛋白质的两性解离性质。
生物化学--蛋白质的性质实验
生物化学实验讲义实验一蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应实验目的1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
4．加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
，一、茚三酮反应1.实验原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。
尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.材料、仪器与试剂蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液3.实验操作①取2支试管分别加入鸡蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
二、黄色反应1.实验原理含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。