蛋白质的两性性质及等电点的测定
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。
根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。
不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。
一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。
在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。
2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。
该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。
IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。
其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。
将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。
加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。
每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。
将记录的数据制成曲线图。
由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。
将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。
（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。
b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
蛋白质等电点测定
蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电外表附近的液体中必有与固体外表电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电外表和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用〔例如范德华力〕而和外表紧密结合，构成吸附层〔或称紧密层、斯特恩层〕。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层〔或称滑移面〕。
由于带电外表的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离外表越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体外表上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高说明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定一、实验目的与要求1.掌握蛋白质的两性解离性质；2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。
虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。
因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。
调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。
在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。
三、实验材料、试剂与仪器1.材料与试剂NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。
0.5 %酪蛋白溶液：0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~8.5）；0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有0.57mL0.1mol/LNaOH的水中。
该指示剂的变色范围是：酸性（pH3.8）为黄色，pH5.4为蓝色；0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可；0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL；0.1 mol/L的乙酸溶液：将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。
实验1：蛋白质的两性电离和等电点-文档资料
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【实践操作】1.取洁净大试管1支，按表如下操作
操 作 步 骤
加入5g/L酪蛋白乙酸钠溶液20 滴，BCG指示剂5滴，混匀后， 观察并记录溶液的颜色。 缓慢滴加0.04mol/L盐酸溶液， 边滴边摇，直至产生明显的大量 沉淀，观察并记录沉淀与溶液颜 色的变化。
结
果
结 果 分 析
颜色 滴数 颜色
继续滴入0.04mol/L盐酸溶液， 直至沉淀全部溶解，观察并记录 沉淀与溶液颜色的变化。
【试剂】
1. 5g/L酪蛋白乙酸钠溶液 2. 0.01%溴甲酚绿（BCG）溶液（指示剂， pH3.8—5.4 pH3.8—5.4） 黄 3. 0.04 mol/L盐酸溶液 4. 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液 5. 1.0 mol/L乙酸溶液 6. 0.1 mol/L乙酸溶液 7. 0.01mol/L乙酸溶液 【器材】 试管 试管架 毛滴管 记号笔
沉淀结果用“-，+，++，+++”表示并记录于表中。
【注意事项】 冒用他人结果，两人成绩全部取消，并加倍扣分。
1.沉淀符号，“－”表示无沉淀，“＋”表示浑浊无明显沉淀，“＋＋” 有明显沉淀，有小颗粒；“＋＋＋”表示大块沉淀。 2.四人共用一组试剂，在本座位，依次轮流添加，不可四处走动。 3.每组派一名代表到前面取一小试管蒸馏水，本组共用。 4.添加各种试剂注意用相应的毛滴管，不可混用！！ 5.注意混匀试管，实验1中添加盐酸和氢氧化钠时注意边添加边震荡试管， 接近PI时逐滴添加，沉淀消失后停止添加试剂，在结果一栏记入添加试剂 的滴数。
6.实验1出现明显沉淀，请老师检查后在实验报告上并签字确认 （应两次出现沉淀）。
7.实验2出现结果后请老师检查确认后给予实验成绩。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。
每组4管，每管加胶液1.8ml。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯1ml酰胺0.8%）10%过硫酸铵0.02ml水 2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2％的500ml硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h。
3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。
实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定
实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定【目的】验证蛋白质的两性电离与等电点性质。
【原理】蛋白质由氨基酸组成。
蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外，其侧链上的某些酸性基团或碱性基团，在一定的溶液pH 条件下，都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。
因此，蛋白质具有两性解离性质。
当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等，既净电荷为零，成为兼性离子，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点（isoelectric point,pI ）。
蛋白质在等电点状态时溶解度最低，容易沉淀析出。
蛋白质在大于其等电点的pH 值溶液中带负电荷；在小于其等电点的pH 值溶液中则带正电荷。
蛋白质在等点电以外的pH 值溶液中，因分子带有同种电荷而相互排斥，不易沉淀。
本实验通过观察酪蛋白在不同pH 溶液中的溶解度来测定其等电点。
＞pI （pH ）pI （pH ）=pI ＜（pH ）PrNH 3+COO -PrNH 3+COOHPrNH 2COO -蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子【操作】1. 蛋白质的两性电离取试管1支，按以下步骤加入各种试剂，观察现象变化并记录。
.；. 2. 酪蛋白等电点的测定取试管5支，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂并混匀。
静置室温20分钟后观察各管沉淀出现情况，并以－，＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋符号记录沉淀的多少。
【思考题】1．为什么说蛋白质是两性电离电解质，何谓蛋白质的等电点？2. 在等电点状态下，为什么蛋白质容易发生沉淀？3. 本实验中酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，由此得出蛋白质在等电点时必然沉淀，此结论对吗，为什么？。
蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性解离及等电点1.蛋白质的等电点（pI）：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质上可解离基团解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零时溶液的pH。
➢等电点时溶解度最小可使蛋白质沉淀。
➢蛋白质pI要用等电聚焦等方法测定。
（二）蛋白质的胶体性质1.胶体溶液的三个条件：①大小在1-100nm范围内：蛋白质分子量很大，属胶体颗粒范围。
②同种电荷互相排斥：相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。
③质点外围有水化层：多肽链上的极性基团极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜。
蛋白质可以形成稳定的胶体溶液。
2.利用胶体溶液性质，可用透析法将蛋白质中小分子杂质除去。
（三）蛋白质的沉淀1.定义：蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或破坏其水化层和双电层，蛋白质胶体溶液因不再稳定而产生沉淀。
此现象即为蛋白质的沉淀作用。
2.类型：分可逆沉淀与不可逆沉淀。
➢可逆沉淀▁非变性沉淀定义：在温和条件下，改变溶液的pH或电荷状况，蛋白质结构和功能没有发生变化。
如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
是分离和纯化的基本方法。
a.等电点沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH等于pI，破坏蛋白质表面净电荷使蛋白质沉淀。
b.盐析沉淀法：1.盐析：通过加入大量高浓度中性盐如硫酸铵、氯化钠等，破坏蛋白质分子表面的水化层，中和它们的电荷，而使蛋白质沉淀析出的现象。
2.各种蛋白质亲水性及荷电均有差别，因此通过调节中性盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的不同蛋白分别沉淀析出，这种方法称为分段盐析。
3.盐溶：加入低浓度盐导致蛋白质溶解度增加的现象。
c.有机溶剂沉淀法定义：加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，破坏蛋白质的水化膜使蛋白质产生沉淀。
注意：通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质发生变性。
➢不可逆沉淀▁变性沉淀定义：沉淀条件剧烈，破坏了蛋白质胶体溶液稳定性，同时也破坏了蛋白质结构和功能。
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蛋白质的两性性质及等电点的测定
一 实验目的
通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理
蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。
因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
H
R
COOH
N
H 3+
H
R
COO
N
H 3+
H
R
COO H 2N
OH
在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。
在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。
而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。
所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。
若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。
如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。
本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备
(1) 试管架 1个
(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支
四 实验试剂
（1）1mol/L 醋酸溶液：
量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL ，加水至50 mL 。
（2）0.1mol/L 醋酸溶液：
量取1mol/L 醋酸5 mL ，加水至50 mL 。
（3）0.01mol/L 醋酸溶液：
量取0.1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL。
（4）0.2mol/L氢氧化钠溶液：
先称取氢氧化钠（分析纯）2g，加水至50 mL，配成1mol/L氢氧化钠。
然后量取1mol/L氢氧化钠10 mL，加水至50 mL，配制成0.2mol/L氢氧化钠。
（5）0.2mol/L盐酸溶液：
先量取37.2%盐酸（比重1.19）4.17 mL，加水至50 mL，配成1mol/L盐酸。
然后量取1mol/L的盐酸10 mL，加水至50 mL，配成0.2mol/L盐酸。
（6）0.01%溴甲酚绿指示剂：
称取溴甲酚绿0.005g、加0.29 mL 1mol/L氢氧化钠，然后加水至50 mL。
（7）0.5%酪蛋白溶液：
称取纯净酪蛋白0.25g放入50 mL容量瓶内，加水约20 mL，再准确加入1mol/L氢氧化钠5 mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L醋酸5 mL，最后加水稀释至50 mL，充分摇匀。
注：氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定。
五操作步骤
1、蛋白质的两性反应
（1）取两支试管，加0.5%酪蛋白2 mL，再加溴甲酚绿指示剂4-5滴，摇匀。
此时溶液呈兰色，无沉淀生成，说明了什么？
（2）用滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，随加随摇直至有明显大量的沉淀生成，此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点，观察溶液颜色有何变化？
（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少消失。
观察此时溶液的颜色有何变化，说明什么？
（4）滴加0.2mol/L氢氧化钠进行中和，沉淀又出现。
继续滴加0.2mol/L氢氧化钠液，沉淀又逐渐消失，从溶液的颜色变化说明什么？
注：溴甲酚绿的变化范围pH3.8-5.4。
2、蛋白质等电点的测定
取5支试管依次标号，按下列表格添加试剂，立即摇匀，观察混浊度。
各管混浊度以-、±、+、++、+++表示。
指出酪蛋白的等电点。
1 2 3 4 5
0.5%酪蛋白（mL）
蒸馏水（mL）
0.01mol/L醋酸（mL）0.1mol/L醋酸（mL）1.00
8.38
0.62
—
1.00
8.75
—
0.25
1.00
8.00
—
1.00
1.00
5.00
—
4.00
1.00
7.40
—
—
编
号试
剂
六实验结果
1、解释上述实验反应的现象
2、指出酪蛋白的等电点。