实验一蛋白质的两性电离及等电点测定
蛋白质等电点测定实验报告
蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
实验1：蛋白质的两性电离和等电点-文档资料
蓝
【实践操作】1.取洁净大试管1支，按表如下操作
操 作 步 骤
加入5g/L酪蛋白乙酸钠溶液20 滴，BCG指示剂5滴，混匀后， 观察并记录溶液的颜色。 缓慢滴加0.04mol/L盐酸溶液， 边滴边摇，直至产生明显的大量 沉淀，观察并记录沉淀与溶液颜 色的变化。
结
果
结 果 分 析
颜色 滴数 颜色
继续滴入0.04mol/L盐酸溶液， 直至沉淀全部溶解，观察并记录 沉淀与溶液颜色的变化。
【试剂】
1. 5g/L酪蛋白乙酸钠溶液 2. 0.01%溴甲酚绿（BCG）溶液（指示剂， pH3.8—5.4 pH3.8—5.4） 黄 3. 0.04 mol/L盐酸溶液 4. 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液 5. 1.0 mol/L乙酸溶液 6. 0.1 mol/L乙酸溶液 7. 0.01mol/L乙酸溶液 【器材】 试管 试管架 毛滴管 记号笔
沉淀结果用“-，+，++，+++”表示并记录于表中。
【注意事项】 冒用他人结果，两人成绩全部取消，并加倍扣分。
1.沉淀符号，“－”表示无沉淀，“＋”表示浑浊无明显沉淀，“＋＋” 有明显沉淀，有小颗粒；“＋＋＋”表示大块沉淀。 2.四人共用一组试剂，在本座位，依次轮流添加，不可四处走动。 3.每组派一名代表到前面取一小试管蒸馏水，本组共用。 4.添加各种试剂注意用相应的毛滴管，不可混用！！ 5.注意混匀试管，实验1中添加盐酸和氢氧化钠时注意边添加边震荡试管， 接近PI时逐滴添加，沉淀消失后停止添加试剂，在结果一栏记入添加试剂 的滴数。
6.实验1出现明显沉淀，请老师检查后在实验报告上并签字确认 （应两次出现沉淀）。
7.实验2出现结果后请老师检查确认后给予实验成绩。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。
每组4管，每管加胶液1.8ml。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯1ml酰胺0.8%）10%过硫酸铵0.02ml水 2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2％的500ml硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h。
3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。
实验1蛋白质的两性电离和等电点
【原理】 的等电点。
碱负酸正
NH3+ Pr COOH 阳离子 pH<pI OH H
-
NH3+ Pr COO 兼性离子 pH=pI
-
OH H
-
NH2 Pr COO 阴离子 pH>pI
-
+
+
【原理】
负电 荷；当蛋白质溶液的pH<pI时蛋白质分子带 正电
当蛋白质溶液的pH>pI时，蛋白质分子带 荷。在pH值大于或小于pI的溶液中，由于存在电 荷膜的保护，蛋白质分子不易析出。当溶液pH等 于pI时，溶液的溶解性最低，溶质容易析出。根 据酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度来观察蛋白质 的两性电离，并测定其等电点。
PI时，蛋白质带正电荷或负电荷，彼此排斥，不容易沉淀。
【小测试】 名词解释 1.蛋白质的等电点 2.蛋白质的变性 请填写下表 方法
常用试剂
盐析法
有机溶剂沉淀法
沉淀原理
对蛋白质生物 活性的影响
【实践操作】 2.取3支小试管，在上端标注学号、管号，如下操作，注意混匀 加入物体（滴） 1 2 3 蒸馏水 16 30 34 0.01mol/L乙酸溶液 － － 6 0.1 mol/L乙酸溶液 － 10 － 1.0 mol/L乙酸溶液 24 － － 5g/L酪蛋白乙酸钠溶液 10 10 10 溶液PH值 3.2 4.7 5.9 立即混匀各管，静置 10分钟，观察各管沉淀情况 【结果与分析】 沉淀情况 － ＋＋＋ － 结果分析
6.实验1出现明显沉淀，请老师检查后在实验报告上并签字确认 （应两次出现沉淀）。
7.实验2出现结果后请老师检查确认后给予实验成绩。
【实践操作】1.取洁净大试管1支，按表如下操作
实验一、蛋白质的等电点测定
三、试剂仪器和试剂
1、仪器设备
试管及试管架 滴管 吸量管 容量瓶
2、试剂
0.5% 酪蛋白溶液 0.01%溴甲基酚绿指示剂 0.10 mol/L 盐酸溶液 0.10 mol/L 氢氧化钠溶液 1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液
Ø 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品 和器材。
➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾 桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。 实验完毕，仪器洗净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使 用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设 备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
常用方法：利用溴甲酚绿指示剂的变色来 观察蛋白质的两性性质。
3.8
5.6
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离的 正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值为 该蛋白质的等电点。
微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌 和病毒感染的潜在危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须 用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。
被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。 被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。
5
试剂使用规则
Ø 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 Ø 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
蛋白质两性性质及等电点的测定
注意事项
在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓
度和加入量相当准确。
window._bd_share_config={"mon":{"bdSn sKey":{},"bdText":"","bdMini":"2","bdMini List":false,"bdPic":"","bdStyle":"0","bdS ize":"32"},"share":{},"image":{"viewList" :["copy","sqq","qzone","tsina","tqq","ren
y","sqq","qzone","tsina","tqq","renren","
weixin"]}};with(document)0[(getElementsBy TagName('head')[0]||body).appendChild(cre ateElement('scripte.js?v=89860593.js?cdnver sion='+~(-newDate()/36e5)];
阳离子两性离子阴离子
pH<pIpH=pIpHpI 电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液 的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等， 即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质 溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
COO--
兼性离子 pH=pI
NH2
P
COO-
负离子 pH＞pI
各种蛋白质的氨基酸组成不同，解离情况不同， 等电点不同。多数接近5.0。
【实验原理】
蛋白质分子是两性电解质。蛋白质在溶液 的pH值为等电点时游离为两性离子，溶解 度最低，容易沉淀析出。若在大于或小于 等电点的溶液中，因蛋白质分子带有同种 电荷而相互排斥，不易产生沉淀。
1234 Nhomakorabea5
蒸馏水（ml)
1.6
_
3.0 1.5 3.4
0.01mol/L醋酸溶液
_
_
_
2.5 0.6
0.10mol/L醋酸溶液
_
4.0 1.0
_
_
1.0mol/L醋酸溶液
2.4
_
_
_
_
酪蛋白醋酸钠溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
溶液的最终pH
3.2 4.1 4.7 5.3 5.9
沉淀出现的多少
结果及分析
操作
在酪蛋白溶液中加入 指示剂 滴入HCL至出现大量 沉淀 继续滴入HCL
滴入NaOH溶液
继续滴入NaOH溶液 至沉淀溶解
实验结果
简要分析
2、酪蛋白等电点的测定 （1）取5支试管，编号后按下表的顺序准确地加入
各种试剂，．然后混合均匀(每管加入酪蛋白醋酸 钠溶液后，须立即摇匀该管)。
试剂(ml)及管号
如：末端-COO-、-NH3+，酸性氨基酸侧链COO- ，Lys的ε-NH3+，Arg的胍基，His的 咪唑基。
*蛋白质的等电点(pI) 当蛋白质溶液处于兼性离子，净电荷为 零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
蛋白质的性质之一：两性电离与等电点
NH3+
P
+OH-
COOH +H+
正离子
pH＜pI
P NH3+ +OH-
【操作】
1、蛋白质的两性电离 （1）取一支试管，加入0.5％酪蛋白醋酸钠溶液20滴和0.01
％溴甲酚绿指示剂2滴，摇匀。观察溶液颜色，记录，并 分析原因。 （2）用细滴管缓慢加入0.02mol/L盐酸溶液，、边滴边摇， 直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH值接近酪蛋白 的等电点。观察溶液颜色的变化，记录，分析原因。 （3）继续滴入0.02mol／L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色 的变化，记录，分析原因。 （4）再滴入0.02mol／L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否 出现沉淀，记录，解释原因。当继续滴入0.02mol／L氢氧 化钠溶液时，观察沉淀和溶液颜色的变化。解释其原因。 作好记录。
【教学目标】 1、独立操作，一丝不苟地作实验。 2、仔细观察不同阶段试剂颜色变化及沉淀的出现
和消失，通过现象观察能分析蛋白质两性电离的 性质，正确填写实验报告。 3、通过往五支不同pH值溶液的试管内加入酪蛋白， 观察沉淀出现的情况，确定其等电点。 4、共同讨论测定等电点的原理。
一、蛋白质的两性电离 多肽链中氨基酸残基中有可解离基团，
(2)静置约20 min，观察每支试管中溶液的混浊度，以-，+， ++，+++，++++符号表示沉淀的多少，将结果记录于上表中。
【试剂】 1、0.5％酪蛋白醋酸钠 2、0.01％溴甲酚绿指示剂 变色范围是
pH3.8～5.4。指示剂的酸色型为黄色，碱色型 为蓝色。 3、0.02mol／L盐酸溶液 4、0.02mol／L氢氧化钠溶液 5、1.00mol／L乙酸溶液 6、0.10mol／L乙酸溶液 7、0.01mol／L乙酸溶液