蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告一、实验目的1、掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、学会使用分光光度计进行比色测定。
3、熟悉标准曲线的绘制和应用，能够通过标准曲线计算样品中蛋白质的含量。
二、实验原理双缩脲试剂是由硫酸铜和酒石酸钾钠在碱性条件下生成的淡蓝色的络合物。
当含有两个或两个以上肽键的化合物与双缩脲试剂反应时，会形成紫色的络合物。
蛋白质分子中含有多个肽键，因此在碱性条件下能与双缩脲试剂反应产生紫色复合物。
颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，在一定范围内符合朗伯比尔定律，可通过比色法测定其吸光度，进而计算出蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1、材料（1）标准蛋白质溶液：称取结晶牛血清白蛋白（BSA） 10mg，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，配制成100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
（2）待测蛋白质溶液：＿____（3）双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O） 15g 和酒石酸钾钠60g，分别用蒸馏水溶解，然后混合，加入 300ml 10%氢氧化钠溶液，并用蒸馏水定容至 1000ml，摇匀，避光保存。
2、仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）移液器（4）容量瓶（100ml、50ml）（5）试管及试管架四、实验步骤1、标准曲线的绘制（1）取 6 支干净的试管，按下表加入试剂：｜管号｜ 1 ｜ 2 ｜ 3 ｜ 4 ｜ 5 ｜ 6 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白质溶液（ml）｜ 0 ｜ 02 ｜ 04 ｜ 06 ｜ 08 ｜ 10 ｜｜蒸馏水（ml）｜ 10 ｜ 08 ｜ 06 ｜ 04 ｜ 02 ｜ 0 ｜｜蛋白质含量（μg）｜ 0 ｜ 20 ｜ 40 ｜ 60 ｜ 80 ｜ 100 ｜（2）向各管中加入 4ml 双缩脲试剂，摇匀，在室温（20-25℃）下放置 30 分钟。
（3）以第 1 管为空白对照，在 540nm 波长处用分光光度计测定各管的吸光度（A）值。
（4）以蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度（A）值为纵坐标，绘制标准曲线。
蛋白物质鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质的鉴定方法。
2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质鉴定实验。
3. 了解蛋白质鉴定实验的原理及注意事项。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，具有复杂的结构和多种生物学功能。
蛋白质的鉴定主要基于其特有的氨基酸序列和空间结构。
本实验采用双缩脲试剂鉴定蛋白质，原理如下：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与Cu2+离子发生反应，形成紫红色的络合物。
络合物的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，从而实现蛋白质的定量分析。
三、实验材料1. 蛋白质样品：鸡蛋清、牛奶、豆奶等。
2. 双缩脲试剂：A液（含0.1g/mL NaOH溶液）、B液（含0.01g/mL CuSO4溶液）。
3. pH试纸、试管、移液器、滴管、白瓷板等。
四、实验步骤1. 准备样品：分别取鸡蛋清、牛奶、豆奶等蛋白质样品，用蒸馏水稀释至适当浓度。
2. 检测蛋白质含量：取3支试管，分别加入0.5mL鸡蛋清、牛奶、豆奶样品，再加入1mL蒸馏水。
3. 添加双缩脲试剂：向每支试管中加入1mL A液，摇匀。
4. 观察颜色变化：静置5分钟，观察溶液颜色变化。
5. 比色：取3支试管，分别加入1mL A液、B液，摇匀。
将上述样品试管与比色管进行比对，观察颜色深浅。
五、实验结果与分析1. 鸡蛋清、牛奶、豆奶样品在加入双缩脲试剂后，溶液颜色均呈紫红色，说明蛋白质含量较高。
2. 比色结果显示，鸡蛋清样品颜色最深，牛奶次之，豆奶最浅。
这可能是因为鸡蛋清中的蛋白质含量最高，牛奶次之，豆奶最低。
六、实验讨论1. 本实验中，双缩脲试剂对蛋白质的鉴定具有较高的灵敏度，能够有效区分不同蛋白质样品。
2. 实验过程中，应注意pH值对蛋白质鉴定的影响。
本实验采用碱性条件，有利于蛋白质与Cu2+离子发生反应。
3. 实验结果受蛋白质样品浓度、试剂比例等因素影响。
在实验过程中，应严格控制这些因素，以确保实验结果的准确性。
七、实验结论通过本实验，我们掌握了蛋白质的鉴定方法，学会了使用双缩脲试剂进行蛋白质鉴定实验。
蛋白质定量生化实验报告
一、实验背景蛋白质是生物体内的重要功能分子，具有多种生物学功能，如催化、结构、运输、信号传导等。
因此，蛋白质定量分析在生物科学研究中具有重要意义。
本实验旨在通过双缩脲法对蛋白质进行定量测定，并分析实验结果。
二、实验目的1. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；2. 学会操作双缩脲试剂，并观察蛋白质定量结果；3. 分析实验数据，探讨蛋白质定量结果的影响因素。
三、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理是：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子（Cu2+）发生反应，生成紫红色的络合物。
该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量呈线性关系，通过测定吸光度可以计算出蛋白质的浓度。
四、实验材料1. 实验试剂：- 双缩脲试剂A：0.1g/L硫酸铜溶液；- 双缩脲试剂B：0.01g/L酒石酸钾钠溶液；- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白）；- 未知蛋白质样品；- 蒸馏水；- 6mol/L氢氧化钠溶液；- 50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。
2. 实验仪器：- 分光光度计；- 移液器；- 试管；- 烧杯；- 玻璃棒。
五、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准蛋白质溶液； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 加入0.2mL双缩脲试剂A；- 混匀，静置10分钟；- 加入0.4mL双缩脲试剂B；- 混匀，静置10分钟；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知蛋白质样品：- 取6个试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL未知蛋白质样品； - 加入1.8mL蒸馏水，使总体积为2.0mL；- 按照步骤1中的方法进行操作；- 以蒸馏水为空白，在540nm处测定吸光度；- 通过标准曲线计算未知蛋白质样品的浓度。
六、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R2=0.998。
双缩脲法测定实验报告
一、实验目的1. 学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
2. 掌握双缩脲试剂的配制和使用。
3. 了解实验过程中可能出现的误差及解决办法。
二、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理基于蛋白质分子中的肽键与铜离子（Cu2+）在碱性条件下发生反应，生成紫红色络合物。
该络合物在特定波长（如540nm）处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系。
通过测量吸光度，可以计算出蛋白质的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准液（已知浓度）- 待测样品（含有未知蛋白质）- 双缩脲试剂A（含CuSO4）- 双缩脲试剂B（含NaOH）- 6mol/L NaOH溶液- 0.1mol/L HCl溶液- 10g/L NaCl溶液- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计2. 实验仪器：- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计四、实验步骤1. 配制双缩脲试剂：- 称取0.1g硫酸酮（CuSO4）溶于50mL去离子水中。
- 称取1.5g酒石酸钾钠溶于50mL去离子水中。
- 称取0.05g碘化钾溶于50mL去离子水中。
- 将三种溶液混合，搅拌均匀，备用。
2. 准备蛋白质标准液：- 将蛋白质标准液用去离子水稀释至一定浓度，备用。
3. 准备待测样品：- 称取一定量的待测样品，用去离子水稀释至一定浓度，备用。
4. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL蛋白质标准液，然后依次加入1.5mL双缩脲试剂A和1.5mL双缩脲试剂B。
- 将试管放入水浴中加热10分钟，取出冷却至室温。
- 用移液器取0.5mL溶液于比色皿中，以空白试剂为参比，在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
5. 待测样品的测定：- 按照标准曲线的制作步骤，对待测样品进行测定。
- 根据标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 在540nm波长处，蛋白质含量与吸光度呈良好的线性关系，相关系数R²=0.998。
双缩脲法试验一蛋白质含量测定
0 0 3 2
1 2 3 4 5 6 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 2 2 2 2 2 2
实验一 蛋方法
2．样液测定
取未知浓度的蛋白液 3.0ml 置试管内，加入双缩尿试剂 2.0ml ，混匀，测其 540nm 的值，对照标准曲线方程， 求得未知液蛋白浓度。 ( 注意：计算浓度时，不要把 2ml 双缩脲试剂计算在内，只
生化技术实验
生物实验中心 2009.10
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 了解其它一些蛋白质定量方法。
(BCA 法、 folin- 酚试剂法，即 lowry 法，紫外分光光度 法,280nm）
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
二、原理：
一.
实验目的
了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解 目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互
关系。
掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法
与注意事项。
并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。
二 .实验原理
用热水提取真菌植物子实体中的多糖 , 利用 多糖类物质在热水中溶解度较高 , 将其提取 出来。 利用 sevag 试剂将游离蛋白变性成为不溶性 物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的 目的 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将 多糖从溶液当中沉降出来。
三、 仪器
中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、 高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发 仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、 移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。
蛋白质测定实验报告
一、实验目的1. 理解蛋白质测定的原理和方法。
2. 掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的基本操作步骤。
3. 学会使用分光光度计进行蛋白质定量分析。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子有机化合物，具有重要的生物学功能。
蛋白质含量是生物样品中的重要指标之一。
本实验采用双缩脲试剂法测定蛋白质含量，该法基于蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子发生反应，生成紫红色络合物，其吸光度与蛋白质含量成正比。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、牛血清白蛋白、牛血清、双缩脲试剂A、双缩脲试剂B、蒸馏水、分光光度计等。
2. 试剂：（1）双缩脲试剂A：称取硫酸铜0.1g，溶于50mL蒸馏水中；（2）双缩脲试剂B：称取酒石酸钾钠0.5g、碘化钾0.1g，溶于50mL蒸馏水中；（3）蛋白质标准溶液：配制浓度为0.1mg/mL的蛋白质标准溶液。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）取6支10mL具塞试管，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL蛋白质标准溶液；（2）向各试管中加入1.5mL双缩脲试剂A；（3）混匀，室温放置10分钟；（4）加入5mL双缩脲试剂B；（5）混匀，室温放置10分钟；（6）以蒸馏水为空白，用分光光度计在540nm波长处测定吸光度；（7）以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定（1）取6支10mL具塞试管，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL待测样品；（2）同标准曲线绘制步骤，测定吸光度；（3）根据标准曲线，计算样品蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为：y = 0.0019x + 0.0032，相关系数R² = 0.9986。
2. 样品测定根据标准曲线，计算各样品蛋白质含量如下：（1）鸡蛋清：0.5mg/mL；（2）牛血清：0.4mg/mL。
双缩脲反应实验报告
一、实验目的1. 了解双缩脲反应的原理及实验方法。
2. 掌握双缩脲试剂的配制方法。
3. 学会使用分光光度计进行定量测定。
4. 分析实验结果，验证双缩脲反应的原理。
二、实验原理双缩脲反应是蛋白质和多肽分子中肽键在碱性溶液中与硫酸铜反应，生成紫红色的络合物。
该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。
通过测定吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理如下：1. 蛋白质和多肽分子中含有大量的肽键（-CO-NH-）。
2. 在碱性溶液中，肽键与Cu2+离子发生络合反应，生成紫红色的络合物。
3. 紫红色络合物在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准溶液（如牛血清蛋白）- 待测样品- 双缩脲试剂A（含CuSO4）- 双缩脲试剂B（含NaOH）- 6mol/L NaOH溶液- 0.1mol/L HCl溶液- 容量瓶- 移液器- 分光光度计- 10mm光程比色皿2. 实验仪器：- 电子天平- 烧杯- 玻璃棒- 移液管- 滴定管四、实验步骤1. 标准曲线的制作：- 准备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液。
- 将标准溶液按照一定比例稀释，使其浓度在10～120g/L范围内。
- 取10mm光程比色皿，依次加入标准溶液、双缩脲试剂A、双缩脲试剂B，混匀。
- 在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度。
- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待测样品的测定：- 取10mm光程比色皿，依次加入待测样品、双缩脲试剂A、双缩脲试剂B，混匀。
- 在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度。
- 从标准曲线上查出待测样品的蛋白质含量。
3. 结果分析：- 根据实验数据，计算待测样品的蛋白质含量。
- 分析实验结果，验证双缩脲反应的原理。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 标准曲线呈线性，相关系数R²>0.99，说明双缩脲反应在实验条件下具有良好的线性关系。
双缩脲法测定蛋白质含量实验报告
1. 理解并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理。
2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质含量的测定。
3. 通过实验，了解实验误差的产生及其控制方法。
二、实验原理双缩脲法是一种基于蛋白质分子中肽键与铜离子反应产生紫色络合物的分析方法。
当蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子作用时，会形成紫红色的络合物。
该络合物在540nm波长处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系，因此可以通过测定吸光度来推算蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准品- 待测蛋白质样品- 双缩脲试剂- 6mol/L的NaOH溶液- 0.1g/mL的硫酸铜溶液- 7支试管- 移液器- 分光光度计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 电子天平- 移液管- 量筒1. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的蛋白质标准品溶液，用水补足至1ml。
- 各管中加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 取待测蛋白质样品1ml，加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。
- 在室温下反应30分钟。
- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。
- 从标准曲线上查找对应的蛋白质含量。
五、实验结果与分析根据实验步骤，绘制标准曲线，并在标准曲线上查找待测样品的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品的蛋白质含量为X mg/mL。
六、实验讨论1. 误差分析：- 误差主要来源于实验操作、试剂质量、仪器精度等因素。
- 为了减少误差，需要严格控制实验操作，使用高精度的仪器，并确保试剂质量。
2. 干扰因素：- 双缩脲法测定蛋白质含量时，一些物质可能会产生干扰，如三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等。
- 为了排除干扰，可以在实验前对样品进行预处理，如透析、凝胶过滤等。
3. 注意事项：- 在使用双缩脲试剂时，必须注意试剂的配制和储存条件。
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生物化学实验报告
姓名：
学号：
专业年级：
组别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法
实验日期实验地点
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；
1.2.掌握双缩脲试剂的配制；
1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义；
1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。
二、实验原理
2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。
三、材料与方法：
3.1.实验材料：
3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。
3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。
3.2.实验步骤
四、结果与讨论：
4.1.实验现象：
①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。
测定次数
1 2 3 平均吸光度
②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U 试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。
（如图一）
图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数
S 0.185 0.184 0.185 0.1847
U 0.152 0.151 0.152 0.1517
结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。
4.3.结果讨论
经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L，符合情况。
4.3.1.成功原因：
①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。
B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。
管号
②吸光度测试后得到的数据，经计算后得到了预期中的结果，是因为前面操作严谨。
4.3.2.误差分析
①三次重复测定过程中出现了一些浮动数据，可能是因为仪器本身存在的可允许的误差范围。
②第一次尝试使用分光光度计的时候得到了负值，经查明是因为放置在其内的比色杯将磨面对准了通光面，经调整后，获得了正确的数据。
4.4.课后复习题
4.4.1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？
答：双缩脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂，遇到蛋白质显紫色。
它是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由0.1g/ml氢氧化钠或氢氧化钾、0.01g/ml硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
硫酸铜、酒石酸钾钠的碱性溶液中会生成紫红色络合物,在这种比例的碱性水溶液中，本来形成的Cu(OH)2会与溶液中多余的OH-形成[Cu(OH)4]2- 络离子，酒石酸钾钠的作用就是保护这种络离子不被析出变为沉淀，向试剂中加入碘化钾,可延长试剂的使用寿命。
4.4.2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入？
答：先单独加入NaOH溶液是为了营造一个碱性环境,在碱性环境下双缩脲试剂B中的Cu2+与蛋白质肽键络合产生颜色反应.如果先将双缩脲试剂A与双缩脲试剂B混合,即NaOH与CuSO4溶液混在一起,那么就会产生Cu(OH)2沉淀,药剂就会失去作用,看不到效果,也就无法判断是否存在蛋白质.
4.4.3.简述血清总蛋白测定的临床意义。
答：临床上，当血清总蛋白浓度降低时，可能代表：血清总蛋白浓度降低、蛋白质合成障碍、蛋白质丢失增加、营养不良或消耗增加或血浆稀释。
当血清总蛋白浓度增高时，可能代表：因多发性骨髓瘤而引起的蛋白质合成增加或因脱水、休克而引起的血浆浓缩：。