蛋白质测定方法之双缩脲法(BIURET法)
蛋白质测定方法之双缩脲法(Biuret法)
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
【生物化学实验】双缩脲法测定血清蛋白质含量
实验开始！
3.0
标准管 2×2 3×2 4×2
0.4
0.6
0.8
—
—
—
0.6
0.4
0.2
3.0
3.0
3.0
5×2 1.0
— — 3.0
测定管 ×2
—
0.1 1.9 3.0
✓ 混匀各管，室温放置30分钟。以空白管调零，在波 长540 nm比色，读取各管光吸收值，并记录。
在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标， 两管平均光吸收值为纵座标，绘制标准曲 线。
➢ 常用方法：
1. 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线 不同，表明物质的化学结构不同。
2. 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同； 化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不 同。
3. 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定)
利用吸收光谱对物质进行定量分析
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法
染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。
实验目的 掌握双缩脲法测定蛋白质的原理 掌握分光光度计的使用 掌握标准曲线的制作 学习分光光度法测定的原理和方法
实验原理
双缩脲反应（Biuret reaction）
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2NOC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接 的酰胺键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲 反应，生成紫红色络合物。
➢ 原理： Lambert-Beer定律
➢ 常用方法：
1. 标准曲线法
2. 配制一系列已知不同浓度的标准溶液，用选定的显 色剂显色。选用合适波长的入射光。测定时先以空白 溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸光 度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条 通过原点的直线，叫做标准曲线（或称A-C曲线）。
蛋白质含量的测定
蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH|+ 3H2SO4 →2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH21702NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O +Na2SO4 + 2NH3(3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
蛋白质含量的测定方法
蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定是我们判断每一种食物是否含有高蛋白，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的检测方法有一定的认识。
一般我们在生活中检查蛋白质含量的方法是通过硫酸铜的方法，也可以通过酚试剂的方法，所以大家觉得哪种方法比较方便，我们建议大家可以尝试一下文章介绍的方法。
双缩脲法(Biuret法)灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏;不同蛋白质显色相似。
紫外吸收法较为灵敏50～100mg快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶;Folin-酚试剂法(Lowry法)灵敏度高～5mg慢速40～60分钟双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和phe还原硫酸铵;Tris 缓冲液;甘氨酸;各种硫醇耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化。
考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5mg快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液;SDS最好的方法;干扰物质少;颜色稳定;颜色深浅随不同蛋白质变化。
硫酸铜法：称取0.2g硫酸铜，6g硫酸钾，把0.5g粉碎好的大豆(不用测量水分的)用滤纸包好放入定氮瓶中中，加20ml硫酸，(瓶口上放一个小漏斗，防止蛋白跑掉)小火在电炉子上消化，等没有碳化颗粒，并处于澄清状态时，拿下来凉一会。
再加过氧化氢直到把瓶颈上的蛋白冲洗干净为止，再消化30分钟。
拿下来，等凉。
通过这篇文章对于蛋白质含量测定方法的介绍，我们应该都知道如何在生活检查蛋白质的含量，所以我们建议大家应该要对于蛋白质的测定方法进行分析。
一般我们在生活中检测蛋白质的方法是比较多的，希望你们可以采纳文章介绍的方法。
蛋白质含量测定方法汇总
实验七蛋白质含量测定测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。
[目的要求]1．掌握测定蛋白质的含量根本方法。
2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。
一、染料法[实验原理]在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收顶峰从460nm移至595nm。
利用这个原理可以测定蛋白质含量。
该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反响时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
[器材]吸量管；试管；721型分光光度计[试剂]1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。
2.待测蛋白质溶液。
3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-2500.1g溶于95%的酒精50ml，再参加85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤]按上表分别向各支试管内参加各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值〔A〕。
以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
2．样品测定：取1ml样品溶液〔约含25～250微克蛋白质〕，参加染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量[实验原理]在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反响称双缩脲反响。
凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反响。
测量蛋白质含量的几种方法以及优缺点
一、染料法
优点：因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。
缺点：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
缺点：灵敏度差。
因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、酚试剂法测定血清蛋白质含量
（改良Lowry法）
优点：方法简便，灵敏度高，能够测定2～100μg的微量蛋白质。
其方法凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高100倍左右。
因此经常被用于科研与临床检验。
四、紫外吸收法
优点：灵敏度高，仪器设备简单，操作简便。
缺点：准确度不高，有的检测不可用，有限制。
五、凯氏定氮法（Kjeldahl determination）优点：可用于所有食品的蛋白质分析中，操作相对简单费用低。
结果
准确、改进后可以用于微量蛋白质的测定。
缺点：最终测定的是总有机氮而不是蛋白质氮。
精确度低于双缩脲法、试剂有腐蚀性。
六、F olin－酚试剂法（Folin-phenol
Reagent Method ）
优点：灵敏度高，方便简单。
缺点：费时较长，精确控制操作时间
七、考马斯亮蓝法（Coomassie
brilliant blue staining ）
优点：灵敏度高，测定快速，应用广泛，只需一种试剂，用时间短。
缺点：有较大的偏差，而且去污剂等很多试剂对其有干扰。
经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介
充分混匀后, 室温下(20~25℃)放置30min
A540
（二） 绘制标准曲线
以每管蛋白的含量为横坐标,其相对应的A520为纵坐 标绘制标准曲线。
（三）未知样品蛋白质浓度的测定
取2只试管，每只分别加入1ml稀释的未知样品， 再分别加入4ml双缩脲试剂，操作方法同前。
然后，测540nm处光密度值，取其平均值。从绘 制的标准曲线查得未知样品的蛋白浓度。
理和使用方法。
二、实验原理
2
2
2
180℃
加热
H－
＋ NH3
2
2
2
双缩脲
双缩脲反应:碱性环境
O=C HN
H2O C=O
NH
含有两个或两 个以上肽键的
R-CH
CH-R
O=C
Cu
C=O
HN
NH
化合物均有双 缩脲反应
R-CH
CH-R
H2O
紫色络合物
➢ 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲 反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红 色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成 正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无 关，因此被广泛地应用。
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15 分钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时, 其max由465 nm 变为595nm
强碱性缓冲 液；Triton
X-100;SDS
最好的方法; 干扰 物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不同 蛋白质变化
一、实验目的
➢掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理
和方法。
➢进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原
五、实验结果
Y×N
血清样品蛋白质含量 =
×100
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项引言：蛋白质是生物体中一类重要的有机化合物，广泛参与生命活动的调控和执行，因此准确测定蛋白质含量对于许多研究和应用领域具有重要意义。
双缩脲法是一种常用的蛋白质含量测定方法，本文将介绍双缩脲法的原理和操作注意事项。
一、双缩脲法测定蛋白质含量原理双缩脲法是通过测定蛋白质中含有的酪氨酸和组氨酸的数量来确定蛋白质含量的。
在碱性条件下，酪氨酸和组氨酸能与二缩脲酸（DTNB）反应生成黄色产物，通过测定该产物的吸光度可以确定蛋白质的含量。
二、双缩脲法测定蛋白质含量的步骤1. 样品制备：将待测样品溶解于缓冲液中，使其浓度适宜，一般为1-10 mg/mL。
2. 反应体系配置：将待测样品、缓冲液、DTNB和NaOH按照一定比例混合，形成反应体系。
3. 反应进行：将反应体系置于适当的温度下孵育一段时间，使反应充分进行。
4. 吸光度测定：使用分光光度计测定反应体系中产生的黄色产物的吸光度，通常在415 nm波长下测定。
5. 蛋白质含量计算：根据吸光度的测定值，结合标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。
三、双缩脲法测定蛋白质含量注意事项1. 样品制备：样品溶解应充分，避免有团块存在，以保证测定的准确性。
2. 缓冲液的选择：不同样品可能需要不同的缓冲液，应根据样品的特性选择合适的缓冲液。
3. DTNB的浓度：DTNB的浓度应适中，过高或过低都会对测定结果产生影响，一般为0.01-0.1 mol/L。
4. 孵育时间：反应体系的孵育时间应控制在适当范围内，一般为10-30分钟，过长或过短都会对测定结果产生影响。
5. 反应体系的pH值：反应体系的pH值应控制在适当范围内，一般为9-10，过高或过低都会影响反应的进行。
6. 吸光度测定条件：吸光度的测定应在反应结束后尽快进行，避免产物的分解或其它因素对测定结果的干扰。
7. 标准曲线的制备：应制备一条符合线性关系的标准曲线，通过测定一系列不同浓度的蛋白标样来制备标准曲线。
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一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材
1.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。
注意样品浓度不要超过10mg/ml。
三、Folin—酚试剂法（Lowry法）
（一）实验原理。