蛋白质等电点测定和沉淀
实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应(精)
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管号 1 2
3
操作 振荡混匀 加数滴盐酸 振荡混匀 醋酸中和 加数滴盐酸 振荡混匀 碳酸钠中和 加数滴盐酸
现象
解释
思考题
1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 3.什么是蛋白质的等电点？ 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生
沉淀 ？
• 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测 定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸 钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的 等电点。
• 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成 水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体 颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白 质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变， 蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂 中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液 稳定的条件仍然存在（如电荷），并不 析出。因此变性蛋白质并不一定都表现 为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变 性。
蛋白质的沉淀反应可分为 两类。
可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变 化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天 然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析 作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间 作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此 类反应。
不可逆沉淀反应
实验二、蛋白质 等电点测定及沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
蛋白质的性质实验二-蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质沉淀反应结果分析
要点一
蛋白质沉淀反应原理
当溶液的pH值低于或高于蛋白质的 等电点时，蛋白质带负电荷或正电荷 ，容易与其他带相反电荷的物质发生 静电吸引而产生沉淀。沉淀反应可用 于分离纯化和测定蛋白质含量。
要点二
实验结果
实验观察到在pH值低于或高于等电 点时，蛋白质出现沉淀现象。通过离 心分离和称重，测定了沉淀物中蛋白 质的质量和含量。实验结果表明，该 蛋白质在不同pH值下的沉淀效果显 著，可用于蛋白质的分离纯化和含量 测定。
实验试剂
盐酸、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、磷酸盐缓冲液等。
配置不同pH值的缓冲液
选择适当的缓冲液，如醋酸-醋酸钠缓 冲液、磷酸盐缓冲液等。
根据需要配置不同pH值的缓冲液，确 保缓冲液的准确性和稳定性。
蛋白质溶液的等电点测定
将蛋白质溶液与不同pH值的缓冲液混合，观察蛋白质的溶解度变化。
当蛋白质溶解度最低时，记录对应的pH值，即为该蛋白质的等电点。
了解蛋白质的沉淀反应及原理
沉淀反应
蛋白质在某些条件下，失去溶解性从 溶液中析出的现象。
原理
蛋白质的沉淀反应通常与溶液的pH值 、离子强度、温度等因素有关，当这 些因素发生变化时，蛋白质的溶解度 可能会降低，导致沉淀的产生。
02
实验原理
蛋白质等电点的概念及影响因素
蛋白质等电点
蛋白质分子在溶液中处于净电中性状态时的pH值，此时蛋白质的溶解度最低。
通过测定不同pH值下的蛋白质电导率，确定了蛋 白质的等电点。
在实验过程中，观察到了蛋白质的溶解度变化和 电荷性质的变化。
分析实验结果与理论预期的差异
实验结果与理论预期基本一致，没有出现明显的偏差。
实验结果支持了蛋白质等电点沉淀的理论，即当溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低， 容易发生沉淀。
蛋白质的等电点测定与沉淀实验
实验项目一、蛋白质的等电点测定及沉淀反应姓名：指导教师：实验室：组员：成绩：第三部分：实验记录与分析实验现象记录及分析：（一）蛋白质等电点测定（二）蛋白质的盐析1．蛋白质的盐析2．重金属离子沉淀蛋白质3．有机酸沉淀蛋白质4．有机溶剂沉淀蛋白质5．乙醇引起的变性与沉淀第四部分：课后研讨题1.通过本次合作实验后，有否对该项目改进的合理建议。
适当增加对照组和空白组，使实验数据更加科学可信。
2.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？铅、汞是重金属离子，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
3.氯化汞为何能做为杀菌剂？细菌由蛋白质构成，氧化汞是重金属盐，与蛋白质结合能使蛋白质分子内部结构发生重大改变，发生变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。
4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生产水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
5.将本实验中所涉及到的几种蛋白质沉淀方法各举一应用实例加以说明。
（1）盐析：硫酸铵的浓溶液能析出蛋白质。
（2）乙醇引起的变性与沉淀：低温下用乙醇或丙酮短时间作用于蛋白质，用于提纯蛋白质。
（3）重金属离子沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml的蛋白质溶液，再加入3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察现象。
（4）某些有机酸沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察现象。
（5）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支离心管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml 95%乙醇，观察现象。
教师评阅：签名。
实验蛋白质的等电点测定和沉淀反应
3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、实验原理
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的 酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时， 蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场 中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移 动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电 点。不同蛋白质各有特异的等电点。
2
3 4
8.7
8.0 7.4
-
0.3
1.0 -
—
— 1.6
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液、4管的pH依次
为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分 钟后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀） 的一管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质沉淀实验
饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球
蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水， 观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤， 向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此 时析出的沉淀为清蛋白。
• 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的
再溶解。
• 2．重金属离子沉淀蛋白质： 重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的 复合物。 • 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加
片刻，向各管内加水8 ml，然后在第2、
3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 M
醋酸溶液及0.05 M碳酸钠溶液中和之。观
察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管
再加0.1 M盐酸溶液数滴，观察沉淀的再
溶解。解释各管发生的全部现象。
五、实验结果
（一）蛋白质等电点测定
实验一蛋白质的等电点测定和沉淀反应
五、实验结果与报告
实验结果与分析：
➢ 按照实验报告要求记录实验结果并分析。
研讨： 通过本次实验，有否对该项目改进的合理建议。 解释盐析、有机溶剂、等电点、重金属、有机酸沉淀 蛋白质的不同机理。 查阅资料，介绍蛋白质等电点的测定方法。 查阅资料，介绍生物大分子制备常用的沉淀方法。 蛋白质变性有哪些方面的应用？
沉淀能否重新溶解。
2. 重金属离子沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加3% 硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。
离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉 淀是否溶解？为什么？
3．有机酸沉淀蛋白质
取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液
蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液 （新鲜鸡蛋清:水=1:9）
0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.7 3%硝酸银溶液 5%三氯乙酸溶液 95%乙醇 饱和硫酸铵溶液：25℃，100mL水＋76.7g硫酸铵 0.1 M盐酸溶液 0.1 M氢氧化钠溶液 0.05 M碳酸钠溶液 0.1 M醋酸溶液
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离 的正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值 为该蛋白质的等电点。
实验八 蛋白质的等电点测定和沉淀反应
（二）实 验 原 理
水溶液中的氨基酸为两性离子，因而不能直接
用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛
生 物
与氨基结合，可形成—NH—CH2OH,—N(CH2—OH)2等
化 羟甲基衍生物，使NH3+上的H+游离出来，这样就可
学
实 用碱滴定NH3+放出的H+，测出氨基氮，从而计算氨
在第2、3号管中加一滴甲基红，在分别用
0.1mol/L醋酸溶液和0.2mol/L碳酸钠溶液中和之。
观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加
0.1mol/LHCL溶液数滴，观察沉淀的再溶解。溶
生 物
解后各试管调pH至7后加入乙醇1mL。解释各管发
化 生的全部现象。
学
实
验
三思考题
1.名词解释：
水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白 质等电点沉淀。
甲醛滴定法常用以测定蛋白质水解程度，随着水解 程度的增加，滴定值增加，当水解完全后，滴定值即保
实 持恒定。
验
四 甲醛滴定法(补充材料）
(三）操 作 方 法
取一只烧杯，加入甲醛溶液50ml，加0.5% 酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LNaOH溶液， 使溶液成为微粉红色，临用前中和。取3只锥 形瓶，按下表操作。
由于电位离子的静电引 力，在其周围又吸附了 大量的异号离子，形成 了所谓的“双电层”。
二 蛋白质的沉淀及变性
(三）操 作 方 法
1、蛋白质的盐析
加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中，再加等量
的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出
球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水
生 物
实验一、蛋白质的等电点测定和沉淀反应课件PPT
0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.7 3%硝酸银溶液 5%三氯乙酸溶液 95%乙醇 饱和硫酸铵溶液：25℃，100mL水＋76.7g硫酸铵 0.1 M盐酸溶液 0.1 M氢氧化钠溶液 0.05 M碳酸钠溶液 0.1 M醋酸溶液
甲基红溶液：pH变色范围为4.4-6.2，由红变黄
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四、实验操作
（一）酪蛋白等电点的测定
（1）取4支试管，按下表顺序分别加入各试剂，混匀。
试管号 蒸馏水 0.01 M醋酸 0. 1 M醋酸 1. 0 M醋酸
mL
mL
mL
mL
1
8.4
0.6
-
—
2
8.7
-
0.3
—
3
8.0
-
1.0
—
4
7.4
-
-
1.6
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（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为 5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一 管pH即为酪蛋白的等电点。
如：盐析作用、低温下用乙醇（丙酮）短时间 作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
问题：提纯蛋白质时常用的沉淀方法有哪些?
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➢ 不可逆沉淀反应
蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常 变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金 属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
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蛋白质性质实验
实验六蛋白质的性质（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定（一）目的1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。
（二）原理蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶掖的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此蛋白质的等电点(p1)。
不同的蛋白质有其各自的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质来测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是利用物质在达到等电点时溶解度最小的性质，测定蛋白质溶液的溶解度呈现最低时的溶液pH值，此时的pH倍即为该蛋白质的等电点。
本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度，来测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值的缓冲液．然后向各缓冲溶液中加入酪蛋白，观察沉淀出现并测定酪蛋白的等电点。
（三）实验器材1、水浴锅。
2、温度计。
3、200mL锥形瓶。
4、100mL容量瓶。
5、移液管。
6、试管。
7、试管架。
8、研钵。
（四）材料与试剂1、0.5％酪蛋白醋酸钠溶液：取0.5g酪蛋白．加少量水在研钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质液移入200 mL锥形瓶内，并用少量40～50℃的温水洗涤研钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10 mLlmol/L醋酸钠溶液。
把锥形瓶放入50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至到度，塞紧玻璃塞，混匀。
2、1mo1/L醋酸溶液。
3、0.1mo1/L醋酸溶液。
4、0.01mo1/L醋酸镕液.（五）操作方法2、。
静置20min后，再观察每支试管内溶液的混浊度，以—、＋、＋＋，＋＋＋符号表示沉淀的多少，根据观察结果，指出那一个pH是酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性（一）目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
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