这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦IEF
等电点聚焦
等电聚焦（isoelectric focusing , IEF ）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中， 是 20 世纪 60 年代后才迅速发展起来的重要技术。
IEF 的基本原理是，在电泳槽 中放入两性电解质,如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型） , pH 范围有3〜10、4〜6 5〜7、6〜8 7〜9和8〜10等。
电泳时，两性电解质形成 一个由阳极到阴极逐步增加的 pH 梯度,正极为酸性,负极为碱性。
蛋白质分子 是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性 pH 梯度中进行电泳。
样 品可置于正极或负极任何一端。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的 pH 环 境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的 pH 环境中以阳离子形式向负 极移动。
当置于负极端时，因pH >pI ，蛋白质带负电向正极移动。
随着pH 的下 降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。
当蛋白质移动到与其等电点相应 pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。
因此， IEF 中蛋白质的分离取决于电泳 pH 梯度的分布和蛋白质的pl ,而与蛋白质分子大小和形状无关。
IEF 的优缺点。
优点：①分辨率很高，可把 pI 相差0. 01的蛋白质分开；② 样品可混入胶中或加在任何位置， 在电场中随着电泳的进行区带越来越窄， 克服 了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质 pl 。
④分离速度快， 蛋白质可保持原有生物活性。
缺点： ①电泳中应使用无盐样品溶液， 否则高压中 电流太大而发热。
但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀， 克服方法是在样 品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在 pI 附近易沉淀而影响分离效果，可加 些脲或非离子去垢剂解决。
一、基本原理（1） 人工 pH 梯度：在分离蛋白质时常用一个直立的性，以蔗糖密度梯度 防止对流。
当两个不同pH 的缓冲液互相扩散时，在其混合区间即形成pH 梯度， 称为“人工 pH 梯度”。
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
icief的检测原理
icief的检测原理ICIEF全称为等电点异电聚焦电泳，是基于蛋白质等电点的差异而进行的一种电泳分离技术，广泛应用于蛋白质药物研发、体外和体内性质研究等领域。
以下是ICIEF的检测原理及步骤。
1. 原理ICIEF的原理是利用全自动等电点聚焦电泳仪对样品中蛋白质等电点进行分离。
等电点是指蛋白质带电量为零时的pH值，而异电点则是指带电量正负相等的蛋白质在一定的pH值下呈现出不同的电荷状态。
ICIEF通过将样品中的蛋白质在pH梯度中进行电泳分离，进而获得蛋白质的等电点和异电点等信息，实现对样品的分离和分析。
2. 步骤（1）样品准备：将待检测的蛋白质样品进行预处理，如加入缓冲液、去除杂质等，以确保样品质量的精准和稳定。
（2）试剂制备：制备等电点聚焦电泳所需的缓冲液、样品浸泡液等，在实验室中准备好。
（3）电泳分离：将样品在电泳仪中进行分离，先将试管中的样品放入等电点聚集层，然后采用电场作用将样品分离到等电点的对应位置上。
经过异电点聚焦电泳、固定化定位等步骤，得到以等电点或异电点为参照标记的蛋白质荧光图谱。
（4）图像处理：将得到的蛋白质荧光图谱进行数据提取和峰和面积计算等处理，进而得到蛋白质的等电点和异电点等自身性质。
（5）数据分析：根据处理得到的荧光特征图谱数据，通过ITC或DSC等热化学实验或计算方法，对样品中的蛋白质等电点和异电点等性质进行更加深入的分析和研究。
总之，ICIEF是一种基于蛋白质等电点差异的一种高分辨率分离技术。
它在蛋白质药物研发与生产等方面都有广泛应用，可以快速高效地进行蛋白质荧光特征分析和等电点测定，准确地获取样品中的蛋白质等电点和异电点等自身性质，帮助研究人员更好地了解和研究蛋白质药物的性质和特征，从而推动药物研发和创新发展。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电聚焦电泳.
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的 支持介质分离等电点不同的蛋白 质的电泳技术。
各种蛋白质各自都有一个等电点,在 一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, 在电场中不会迁移。
等电聚焦就是在电泳介质中放入载 体两性电解质，当通以直流电时，两性
pH
pH=pH’
A+
+
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电解
质也会各自迁移到它们的等电点处，由于 它们的数量足够多，各自的等电点相差很 小，从而形成一个pH梯度。（图d）
假设在一个系统中含有极多的 有适当的等电点和它的等电点处有 一定的缓冲能力的两性电解质，因 此形成的pH梯度将是连续平滑的。
pH
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
实验 血红蛋白的等点聚焦电泳
[原理]
Hb具有四条多肽链和球蛋白 （α、β、γ、δ）
HbA HbA2 HbF HbA3
α2β2 α2δ2 α2γ2
>95% 2-3% <2%
2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。
分辨率较不连续PAGE更高，特 别适合于分离分子量相同而电荷不 同的生物大分子。
三、IEFE的基本原理
3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。
等电点聚焦电泳
等电点聚焦电泳等电点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它基于蛋白质在特定条件下在电场中的移动速度与其等电点相关的原理，能够将混合蛋白质样品分离成不同的带状区域，从而实现对蛋白质的纯化和分析。
等电点是指蛋白质在电场中呈等电状态的pH值。
蛋白质在不同的pH值下带有正电荷或负电荷，当蛋白质的等电点与运行缓冲液的pH值相等时，蛋白质净电荷为零，停止运动。
这时，蛋白质会聚焦在等电点处，形成锐利的带状区域。
在进行等电点聚焦电泳实验时，先将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶中存在着一种称为聚丙烯酰胺的高分子物质，它能够提供电泳的通道。
然后，在两端施加电场，使蛋白质在凝胶中向两极运动。
同时，凝胶中的pH值梯度能够使蛋白质在移动过程中逐渐接近其等电点，最终停留在等电点处。
等电点聚焦电泳的优势在于能够分离各种不同等电点的蛋白质，从而实现高分辨率的蛋白质分析。
它可以用于研究蛋白质的异构体、修饰和突变等信息，对于蛋白质组学研究、生物药物的质量控制等具有重要意义。
在等电点聚焦电泳中，pH梯度的建立是关键步骤之一。
常用的方法包括使用缓冲液体系和添加胶体等。
缓冲液体系可以通过选择不同的酸碱成分和浓度来调节pH梯度的范围和形状；而添加胶体则能够改变凝胶中的离子浓度分布，从而调节蛋白质的电泳速度。
等电点聚焦电泳的结果可以通过染色或质谱等方法进行检测和分析。
染色方法可以使用酸性、碱性或中性染料，如银染色、Coomassie 蓝染色等，以可视化蛋白质的带状区域。
质谱分析则可以进一步确定蛋白质的分子量和序列等信息。
除了等电点聚焦电泳，还有其他一些蛋白质分离和分析技术，如SDS-PAGE、凝胶过滤层析、离子交换层析等。
这些方法在不同的情况下可以互补使用，以实现更全面的蛋白质分析。
等电点聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点的分离和分析技术。
它通过建立pH梯度，在电场中将蛋白质聚焦在等电点处，实现高分辨率的蛋白质分离。
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二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
11cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 线性 30分钟 30分钟 4小时 40,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持 1000V 快速 8000V 线性 8000V 快速 500V 快速
双向电泳培训
主要内容
双向电泳培训实验内容
1.样品制备及试剂准备
2.第一向等电聚焦原理及操作 3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶 4.第一向等电聚焦后胶条的处理---平衡及转移 5.第二向SDS-PAGE原理及操作
6.染色及成像
双向电泳培训前期准备工作内容
C. 取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温中放 置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。
D．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+） 对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产 生气泡。
双向电泳上样
水化上样操作
二.第一向等电聚焦原理及操作
双向电泳培训实验内容
二.第一向等电聚焦原理及操作
1. 原理
在第一向分离中蛋白质先按其等电点 （isoelectric point pI值）分开。pI值就是使蛋 白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特 定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技 术称为等电聚焦（IEF）。
Isoelectric Focusing
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
双向电泳培训实验内容
二.第一向等电聚焦原理及操作
2. 操作-----双向电泳上样
A. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽 两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不 要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
B. 胶条长度加样体积样品蛋白量7 cm:125 ul(169 ug), 11 cm:185 ul(250 ug), 17 cm:300 ul(405 ug)-----考马氏亮蓝R-250染色
1.培训使用主要仪器
双向电泳培训前期准备工作内容
2.培训使用主要耗材
双向电泳培训实验内容
一.样品制备及试剂准备
1. 从冰箱中取出4℃保存的双向电泳启动试剂 盒。
2. 在上样缓冲液干粉瓶中加入6.1ml去离子水， 使之溶解。 3. 吸取2ml溶解后缓冲液，加入到E.coli蛋白样 品瓶中，制成浓度为1.35mg/ml的蛋白质样品。
原理
等电点（isoelectric point）:在某一pH时，蛋白质的净电荷为零。 蛋白质的等电点取于它的氨基酸组成和构象
The 1st D: Isoelectric Focusing
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
7cm胶条
水化 12小时（18℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 500V 线性 快速 30分钟 30分钟 3小时 20,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持
4000V 线性 4000V 快速 500V 快速
二.第一向等电聚焦原理及操作
等电聚焦程序
17cm胶条
水化 12小时（20℃） 主动水化（50V）或被动水化 S1 S2 S3 S4 S5 250V 线性 30分钟 1小时 5小时 60,000伏小时 任意时间 除盐 除盐 升压 聚焦 保持 1000V 快速 10000V 线性 10000V 快速 500V 快速
2. 操作-----双向电泳上样
E. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶 条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液 体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条， 使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
F. 对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放 入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。
B. 仪器组装
C. 制胶
配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配12ml凝胶 溶液，每块凝胶6ml，将溶液分别注入玻璃板 夹层中，上部留约1cm的空间，用MilliQ水或 水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合45 分钟。(7cm胶条) 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水 或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。
Carboxylic Groups
Acidic pH R-COO- + H+ => R-COOH Basic pH R-COOH + OH- => R-COO- + H2O
Amino Groups
Acidic pH R-NH2 + H+ => R-NH3+ Basic pH R-NH3+ + OH- => R-NH2 + H2O
C. 制胶
7.5% 30% Acrylamide/Bis 25 ml 12% 40 ml 3.3(X%) = (A)* ml X%
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 25 ml 1.0 ml 25 ml 1.0 ml 25 ml 1.0 ml
10% SDS
双向电泳培训实验内容
3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶 A. 试剂准备 161-0157 30% Acrylamide/Bis Solution, 29:1, 2×500ml预混合制胶液 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0801 TEMED, 50 ml 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0798 Resolving gel buffer, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 1L 161-0416 SDS Solution, 10 % (w/v ), 250 ml