聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂的原因
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂的原因
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作复杂的原因主要有：
1.聚丙烯酰胺凝胶是一种高分子聚合物，其制备和操作需要精细的化学反应条件。
制备过程中，凝胶的浓度、交联剂的用量、反应温度和时间等都需要精确控制，以确保凝胶的质量和稳定性。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，蛋白质的迁移速度受到凝胶孔径大小、电荷、缓冲液pH值和离子浓度等多种因素的影响。
这些因素需要精确控制，以确保蛋白质的正确分离和鉴定。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳通常需要进行染色或检测，以便观察和鉴定蛋白质。
这些检测方法需要特定的试剂和设备，并且需要进行精确的操作，以确保结果的准确性和可靠性。
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验操作需要高度的技术水平和经验。
操作者需要了解凝胶电泳的原理和操作方法，并能够正确地操作凝胶电泳仪、添加样品、进行染色或检测等步骤。
因此，聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作相对复杂，需要操作者具备较高的技术水平和丰富的经验。
同时，为了获得准确的结果，操作者还需要对实验条件和操作过程进行严格的控制和管理。
电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳
.电泳技术.第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术.常见电泳技术第二节纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE.PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。
.1、聚丙烯酰胺凝胶的特点①可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”④电泳分离的重复性好⑤透明度好，便于照相和复印⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存.⑦无紫外吸收⑧可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素.（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= abmbab100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.5−0.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。
当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。
IEF-PAGE聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法
【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法【实验原理】等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。
当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。
蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。
当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。
当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。
这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。
利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。
【实验材料】1.实验器材小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计2.实验试剂(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。
(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。
此蛋白溶液应无盐离子。
(3) 5%磷酸溶液(4) 2%氢氧化钠溶液(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。
(6) 40%蔗糖溶液(7) 12%三氯醋酸溶液(8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。
【实验操作】1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。
2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。
实验操作指导书：等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
5、IEF-PAGE
等电聚焦示意图
双向电泳示意图
双向电泳图谱
电泳装置
操
1. 凝胶柱的制备
作
方 法
（1）玻璃管先用小片的封口膜封口，然后将封口的一端插在 橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中 先加2-3滴30%的甘油或者40%蔗糖) （2）配胶 （按照黑板上的配方加入相应的溶液） 表 凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 30%凝胶贮存液 1.3 ml 蒸馏水 1.9 ml 2mg/ml蛋白质样品 1.5 ml 40%两性电解质载体 0.48 ml TEMED 0.004 ml 充分混匀后 加入10%过硫酸铵 0.04 ml
理想的载体两性电解质的合成
用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六 胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合 反应优先加在α、β饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比 例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机合成 不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求 合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证 的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑 的pH梯度。 载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在 300-1000之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性 能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好， 在1%水溶液中的紫外吸收值（260nm）很低。
解
疑
1、在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 答： 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到 所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系 的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。 2、为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 答：等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值 区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电 解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意.
3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。
电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。
当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。
所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。
5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。
这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。
这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。
双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。
二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。
它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。
近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。
由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。
等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。
这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。
本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。
理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。
常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。
合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。
这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。
混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。
目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。
不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。
等电聚焦电泳名词解释
等电聚焦电泳（Isoelectric focusing (IEF), also known as electrofocusing）是一种电泳方法，即利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在凝胶常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。
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(6)剪取加样纸:
按坐标纸的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加样纸,拨去上
下覆盖的保护纸,取出8层擦镜纸作为加样纸,根据样液浓度
调节加样纸的层数(标准样4层,其它样液均为8层).
(7)加样:
将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的
凝胶中央.
(8)连接电极:
将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上电极板,使铂
带。
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2.3.两性电解质 (1) Ampholine(瑞典LKB) 它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组 成的, pH范围2.5-4.5，4-6.5，5-8，3.5-9.5.
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(2) Servalyte(德国Serva公司) 它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺 混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的. pH范围:2-4, 3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.
金丝压在电极条上.盖上安全可编罩辑p,p接t 通冷凝水.
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(9)电泳:
将电泳仪正极输出端与磷酸电极条相连, 负极输出端与
NaOH电极条相连,接通电源,60V恒压15min, 8mA恒流至
电压上升到 550V,关闭电源,揭去加样纸, 然后在550V恒
压3小时左右,等电流降至接近于零,停止电泳.
(10)固定:
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3.2pH梯度的形成过程 pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度 而定.一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm， 凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质, 电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图
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3 pH梯度的形成 3.1在电场下载体两性电解质的变化 在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液 pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH 约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷,只是 在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零. 引入电 场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在 分子净电荷为零的位置停止迁移.
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2.2.等电聚焦
在常规电泳中,通常只是在恒定的缓冲液中进行分离，假
定有A, B两个蛋白质组分，分别带有净电荷-3和+1。在一
个pH9的缓冲洗脱中,带负电荷的蛋白质均放在靠阴极一侧
电泳,此时带负电荷多的A蛋白质受阳极影响大,泳动速度比
B快,最终会超过B，这样二者就会得到分离。
在等电聚焦电泳中，分离是在连续的pH梯度中进行的。
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(3) Pharmalyte (瑞典Pharmacia) 七氨基多羧基组成的 pH范围: 2.5-5, 4-5.5, 5-8, 8-10, 3-10 等
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(4)载体两性电解质(军事医学科学院) 合成的方式与Ampholine基本相同. pH范围: 3-9.5, 3.5-5.5, 4.0-6.0, 5.0-7.0, 6.0-9.0, 7.0-10.0
取出凝胶,浸泡在40ml的固定液中 摇动约30min,倾出固
定液.再加入60ml的固定液过夜.
(11)染色:
倾出固定液,用蒸馏水漂洗一次,加入考马斯亮蓝R250溶
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2、配试剂(每组用量)
（1）固定液100ml
三氯乙酸10g
磺基水杨酸3.5g
95%乙醇35ml
加蒸馏水至100ml
(2)脱色液100 ml
95%乙醇10 ml
冰醋酸7.5 ml
加蒸馏水至100ml 可编辑ppt
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3、实验步骤 (1) 安装电泳槽,调水平(先平放两块相同厚度玻璃板,上放 塑料模板,一头用铁夹夹住)
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4、实验流程 等电聚焦凝胶溶液配制
↓
安装电泳槽、调水平
↓ 铺胶
↓ 加样
↓ 电泳
↓ 停止电泳
↓ 取胶固定
↓
染色、脱色
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二、实验方法 1、仪器准备及清洗 (1)电泳槽,玻璃板三块, 塑料模板 (2)烧杯 50 ml 一个 (3)量筒
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(1)靠近阳极端的载体两性电解质,电负性最强,具有较强的 缓冲氢离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质的pI, 一直向阴极顺延; (2)靠近阴极端的载体两性电解质,电正性最强,具有较强的 缓冲氢氧根离子的能力,使环境的pH等于载体两性电解质 的pI,一直向阳极顺延。如图
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聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳
一、实验简介 1、实验目的
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验，初步掌握聚焦电泳 的基本原理和实验技术
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2、基本原理 2.1蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质.在不同的pH环境中所带的正 负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零,此时 的pH为该蛋白质的等电点。在电场下不泳动。
A
B
C
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D
E
(2)配凝胶溶液 单体 2ml Ampholine 0.5ml ddH2O 5.5ml TEMED 8μl 10% AP 50μl
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(3)灌胶, 聚胶60分钟 (4)取下玻璃板, 电泳槽上加少许液体石蜡,将坐标纸浸透铺 平整, 坐标纸上放带胶玻璃板 (5)加电极条:取4张滤纸条,其中两张滤纸条浸透1mol/L 磷 酸,另两张浸透1mol/L NaOH, 多余的液滴用滤纸质吸去,然 后对称放在凝胶的两侧.
这是一个”稳态”过程,一旦达到等电点的位置，蛋白质 就会停止迁移。达到稳态后，如果它要正极或负极任何一
侧扩散，均会受到相应的pH制约，即若向负极扩散带负 电,会受到阳极的影响，迫使其扩散后退回原位;若向正极 扩散带正负电,会受到阴极的影响，迫使其扩散后退回原 位。因此，蛋白质能在等电点位置被聚焦成一条稳定的窄
如果把A,B二者的混合物放在一个pH3.5-10的pH梯度中的
pH6的位置，则A蛋白质的净电荷为-2,减少两个净电荷；
B蛋白质的净电荷为+2，多了两个净电荷。在相同的电场
下,A移向阳极,B移向阴极，当它们达到净电荷为零时停止
迁移，这种行为称为聚焦反可应编辑。ppt
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蛋白质在等电聚焦电泳中的分离仅仅决定于其等电点，