化妆品微生物学检验指标与方法新探讨
化妆品微生物五项检测
双倍胆盐乳糖
产酸：黄色 产气：气泡
EMB琼脂
镜检
配培 养基 和稀 释液
供试 液的 制备
化妆品微生物五项检验
菌落总数检验
菌落总数（Aerobic bacterial count）：化妆品检样经过处理,
在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、 pH值、需氧性质等）,1g（1mL）检样中所含菌落的总数.所得 结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性和 兼性厌氧菌落总数.
配培 养基 和稀 释液
供试 品的 处理
耐盐分
Baird Parker’s 或血琼脂
增 菌 24±2h 培 36±1℃ 养
分
离 24~48h 纯 36±1℃ 化
镜检
特征菌落
无菌落或无特征菌落
书写检验 记录单
最终结 果判断
革兰染色、镜检→ 生化试验:血浆凝固酶试验
甘露醇发酵试验
金黄色葡萄球菌检查流程图
灰/黑色
问题2
油性样品如何处理
稀释子型表面活性剂,分子一端 是亲水基团,一端是亲油基团,常用作增溶剂和 油/水乳化剂.决定了加入的顺序.
微生物许可检验项目 问题3
检验项目
特殊用途化妆品
非特殊用途 育 化妆品 发 类
染 发 类
烫 发 类
脱 毛 类
谢谢大家
接种阳性菌计算回收率
推荐了解： 人员培训能力掌握的检验重要指标. 有条件可做视具体样品测试结果. 在膏霜类化妆品中,微生物都是吸附或附着于颗粒状
化妆品微生物检验方法
一、总则之羊若含玉创作本规范划定了化装品微生物磨练的根本要求.本规范适用于化装品样品的收集、保管及供检样品制备.2.1 天平.2.2 高压灭菌器.2.3 振荡器.2.4 三角瓶，250mL.2.5 玻璃珠.2.6 琉璃棒.2.7 刻度吸管，1mL、10mL.2.8 研钵或均质器.2.9 恒温水浴箱.3.1 生理盐水成分：蒸馏水加至 1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌.3.2 SCDLP液体造就基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g葡萄糖 1g吐温80 7g蒸馏水1000mL～7.3分装，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌.注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混杂，冷却至25℃左右使用.注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替.3.3灭菌液体石蜡.3.4灭菌吐温80.4.1 所收集的样品，应具有代表性，一般视每批化装品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位.磨练时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g 或10mL.包装量小于20g的样品，采样量可适当增加样品包装数量.4.2 供磨练样品，应严格保持原有的包装状态.容器不该有破裂，在磨练前不得打开，防止样品被污染.4.3 接到样品后，应立刻登记，编写磨练序号，并按磨练要求尽快磨练.如不克不及实时磨练，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻.4.4 若只有一个样品而同时需做多种剖析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌磨练，再将剩余样品做其它剖析.4.5 在磨练进程中，从打开包装到全部磨练操纵停止，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及资料均应事先灭菌，全部操纵应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操纵划定进行.4.6如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自陈述发出之日起该菌种及被检样品应保管一个月.5.1 液体样品5.1.1 水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按10倍稀释法进行.如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后制成1：10检液.5.1.2 油性液体样品，取样品10mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80,在40℃～44℃水浴中充分混杂，制成1：10检液.5.3 固体样品称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其疏散混悬，静置后，取上清液作为1：10的检液.如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品参加90mL灭菌生理盐水，均质1min～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，参加10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80,70mL灭菌生理盐水，均质3min～5min.二、菌落总数本规范划定了化装品中菌落总数的磨练办法.本规范适用于化装品菌落总数的测定.本规范采取下列界说菌落总数（Aerobic bacterial count）是指化装品检样经由处理，在一定条件下造就后（如造就基成分、造就温度、造就时间、pH值、需氧性质等），1g(1mL)检样中所含菌落的总数.所得成果只包含一群本方律例定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数.测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生总评价的综合依据.3.1 三角瓶，250mL.3.2 量筒，200mL.3.3 pH计或周详pH试纸.3.4 高压灭菌器.3.5 试管：15×150mm.3.6 灭菌平皿：直径9cm.3.7 灭菌刻度吸管，10mL、1mL.3.8 酒精灯.3.9 恒温造就箱：36℃±1℃.3.10 放大镜.4.1 生理盐水：见总则中3.1.4.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂造就基4.2.1成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000mL4.2.2 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，参加吐温80,将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸馏水中，溶解.参加已溶解的卵磷脂、吐温80,混匀，调pH值为7.1～7.4,参加琼脂，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用.4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC）成分：蒸馏水 1000mL溶解后过滤，103.43kPa (121℃15lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用.5.1 用灭菌吸管吸取1：10稀释的检液2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL.另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），改换一支吸管，并充分混匀，制成1：100检液.吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL.如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000,1：10000，……等，每种稀释度应改换1支吸管.5.2 将融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂造就基倾注到平皿内，每皿约15mL,随即转动平皿，使样品与造就基充分混杂平均，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃造就箱内造就48h±2h.另取一个不加样品的灭菌空平皿，参加约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂造就基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃造就箱内造就48h±2h，为空白对比.5.3 为便于区别化装品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中参加1mL 0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，造就后菌落呈红色，而化装品的颗粒颜色无变更.6．菌落计数办法先用肉眼不雅察，点数菌落数，然后再用放大5倍～10倍的放大镜检讨，以防遗漏.记下各平皿的菌落数后，求出同一个稀释度各平皿生长的平均菌落数.若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落舒展生长时，该平皿不宜计数.若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数散布又很平均，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2,以代表全皿菌落数.7.1 首先选取平均菌落数在30个～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的规模.当只有一个稀释度的平均菌落数相符此规模时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表1中例1）.7.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决议，若其比值小于或等于2,应陈述其平均数，若大于2则陈述其中稀释度较低的平皿的菌落数（见表1中例2及例3）.7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数陈述之（见表1中例4）.7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，刚应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数陈述之（见表1中例5）.7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30个～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以30或300的平均菌落数乘以稀释倍数陈述之（见表1中例6）.7.6 若所有的稀释度均无菌生长，陈述数为每g或每mL小于10 CFU.7.7 菌落计数的陈述，菌落数在10以内时，按实有数值陈述之，大于100时，采取二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法盘算.为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来暗示（见表1陈述方法栏）.在陈述菌落数为“不成计”时，应注明样品的稀释度.表1 细菌计数成果及陈述方法例次不合稀释度平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数(CFU/mL或CFU/g）陈述方法(CFU/mL或CFU/g）10-110-210-31 1365 164 20 ——16400 ×1042 2760 295 46 38000 ×1043 2890 271 60 27100 ×1044 不成计4650 513 ——513000 ×1055 27 11 5 ——270 ×1026 不成计305 12 ——30500 ×1047 0 0 0 ——＜1×10 ＜1×10*CFU：菌落形成单位.三、粪大肠菌群本规范划定了化装品中粪大肠菌群的磨练办法.本规范适用于化装品中粪大肠菌群的磨练.本规范采取下列界说粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44℃±℃造就24h～48h能发酵乳糖产酸并产气.该菌直接来自粪便，是重要的卫生指标菌.3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±℃.3.2 温度计.3.3 显微镜.3.4 载玻片.3.5 接种环.3.6 电磁炉.3.7 三角瓶，250mL.3.8 试管：15×150mm.3.9 小倒管.3.10 pH计或pH试纸.3.11 高压灭菌器.3.12 灭菌吸管，10mL、1mL.3.13 灭菌平皿：直径90mm.4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）造就基成分：蛋白胨 40g猪胆盐 10g乳糖 10g0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL卵磷脂 2g吐温80 14g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10lb)20min高压灭菌.4.2 伊红美蓝（EMB）琼脂成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 20g2%伊红水溶液 20mL0.5%美蓝水溶液 13mL蒸馏水 1000mLkPa (121℃15lb)15min高压灭菌备用.临用时参加乳糖并加热融化琼脂.冷至60℃左右无菌操纵参加灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀.倾注平皿备用.4.3 蛋白胨水（做靛基质试验用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g氯化钠 5g蒸馏水 1000mLkPa (121℃ 15lb)15min高压灭菌.4.4 靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后迟缓参加浓盐酸25mL.试验办法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±℃造就24h±2h.沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管.阳性者于试剂层显深玫瑰红色.注：蛋白胨应含有丰硕的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种剖断后方可使用.4.5 革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液：结晶紫 1g95%乙醇 20mL1%草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混杂.4.5.1.2 革兰氏碘液：碘 1g碘化钾 2g蒸馏水加至 300mL将碘与碘化钾先进行混杂，参加蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL.4.5.1.3 脱色液：95%乙醇.4.5.1.4 复染液：（1）沙黄复染液：95%乙醇 10mL蒸馏水 90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释.（2）稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL,放置留宿，滤纸过滤.取该液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL,混杂，即为石碳酸复红液.再取此液10mL加水90mL,即为稀石碳酸复红液.4.5.2 染色法4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗.4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗.4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s,或将乙醇滴满整个涂片，立刻倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s,水洗.4.5.2.4 滴加复染液，复染1min,水洗，待干，镜检.4.5.3 染色成果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色.注：如用1：10稀释石碳酸复红液做复染，复染时间仅需10s.5.1 取10mL 1：10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）造就基中，置44℃±℃造就箱中造就24h～48h，如不产酸也不产气，则陈述为粪大肠菌群阴性.5.2 如产酸产气，则划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃造就18h～24h.同时取该造就液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±℃造就24h±2h.经造就后，在上述平板上不雅察有无典范菌落生长.粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂造就基上的典范菌落呈深紫黑色，圆形，边沿整齐，概况滑腻湿润，常具有金属光泽.也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选.5.3 挑取上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检.5.4 在蛋白胨水造就液中，参加靛基质试剂约0.5mL,不雅察靛基质反响.阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反响液面呈试剂赋性.依据发酵乳糖产酸产气，平板上有典范菌落，并经证实为革兰氏阴性杆菌，靛基质试验阳性，则可陈述被检样品中检出粪大肠菌群.四、铜绿假单胞菌本规范划定了化装品中铜绿假单胞菌的磨练办法.本规范适用于化装品中铜绿假单胞菌的磨练.本规范采取了下列界说铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素.此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长.该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等.3.1 造就箱：42℃±1℃、36℃±1℃.3.2 三角瓶，250mL.3.3 试管：15×150mm.3.4 灭菌平皿：直径90mm.3.5 灭菌刻度吸管，10mL、1mL.3.6 显微镜.3.7 载玻片.3.8 接种针，接种环.3.9 电磁炉.3.10 高压灭菌器.4.1 SCDLP 液体造就基见总则中3.2.4.2 十六烷基三甲基溴化铵造就基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 10g氯化钠 5g琼脂 20g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10lb)20min灭菌后，制成平板备用.4.3 乙酰胺造就基成分：硫酸镁（MgSO4.7H2琼脂 20g蒸馏水 1000mL制法：除琼脂和酚红外，将其它成分加到蒸馏水中，加热溶解，调kPa (121℃ 15lb)20min高压灭菌后，制成平板备用.4.4 绿脓菌素测定用造就基成分：蛋白胨 20g硫酸钾 10g琼脂 18g甘油（化学纯） 10g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用.4.5 明胶造就基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 5g明胶 120g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min高压灭菌后，直立制成高层备用.4.6 硝酸盐蛋白胨水造就基成分：蛋白胨 10g酵母浸膏 3g硝酸钾 2g亚硝酸钠 0.5g蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调kPa (115℃10 lb)20min高压灭菌后备用.4.7 普通琼脂斜面造就基成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g蒸馏水 1000mLkPa (121℃ 15lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用.5.操纵步调5.1 增菌造就：取1：10样品稀释液10mL加到90mLSCDLP液体造就基中，置36℃±1℃造就18h～24h.如有铜绿假单胞菌生长，造就液概况多有一层薄菌膜，造就液常呈黄绿色或蓝绿色.5.2 分别造就：从造就液的薄膜处挑取造就物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±1℃造就18h～24h.凡铜绿假单胞菌在此造就基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略在舒展，概况湿润，菌落呈灰白色，菌落周围造就基常扩散有水溶性色素，此造就基选择性强，大肠埃希氏菌不克不及生长，革兰氏阳性菌生长较差.在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺造就基进行分别，将菌液划线接种于平板上，置36℃±1℃造就24h±2h，铜绿假单胞菌在此造就基上生长优越，菌落扁平，边沿不整，菌落周围造就基略带粉红色，其它菌落不生长.5.3 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验.5.4 氧化酶试验：取一小块干净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸上，然后在其上滴加一新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15s～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若造就物不变色，为氧化酶试验阴性.5.5 绿脓菌素试验：取可疑菌落2个～3个，分别接种在绿脓菌素测定造就基上，置36℃±1℃造就24h±2h,参加氯仿3mL～5mL,充分振荡使造就物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并参加1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置少焉.如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，暗示被检物中有绿脓菌素存在.5.6 硝酸盐还原产气试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯造就物，接种在硝酸盐蛋白胨水造就基中，置36℃±1℃造就24h±2h,不雅察成果.凡在硝酸盐蛋白胨水造就基内的小倒管中有气体者，即阳性，标明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分化产生氮气.5.7 明胶液化试验，取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯造就物，穿刺接种在明胶造就基内，置36℃±1℃造就24h±2h,取出放冰箱10min～30min,如仍呈溶解状或概况溶解时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性.5.8 42℃生长试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯造就物，接种在普通琼脂斜面造就基上，放在42℃±1℃造就箱中，造就24h～48h,铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不克不及生长.被检样品经增菌分别造就后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可陈述被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可陈述被检样品中检出铜绿假单胞菌.五、金黄色葡萄球菌本规范划定了化装品中金黄色葡萄球菌的磨练办法.本规范适用于化装品中金黄色葡萄球菌的磨练.本规范采取下列界说金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状分列，无芽孢，无荚膜，能分化甘露醇，血浆凝固酶阳性.该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症.3.1 显微镜.3.2 恒温造就箱：36℃±1℃.3.3 离心机.3.4 灭菌吸管，1mL、10mL.3.5 灭菌试管：15×150mm.3.6 载玻片.3.7 酒精灯.4.1 SCDLP液体造就基见总则中3.2.4.2 7.5%的氯化钠肉汤成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 75g蒸馏水加至 1000mLkPa (121℃ 15lb)15min 高压灭菌. 4.3 Baird Parker 氏造就基成分：胰蛋白胨 10g牛肉膏 5g酵母浸膏 1g丙酮酸钠 10g甘氨酸 12g氯化锂（LiCl·6H2O） 5g琼脂 20g蒸馏水 950mL±增菌剂的配制：30%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混杂，保管于冰箱内.制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃±1℃kPa (121℃15lb)高压灭菌15min.临用时加热溶化琼脂，每95mL参加预热至50℃左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板.造就基应是致密不透明的.使用前在冰箱贮存不得超出48h±2h.4.4 血琼脂造就基成分：营养琼脂 100mL脱纤维羊血（或兔血） 10mL制法：将营养琼脂加热融化，待冷至50℃左右无菌操纵参加脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用.4.5 甘露醇发酵造就基成分：蛋白胨 10g氯化钠 5g甘露醇 10g牛肉膏 5g0.2%麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min灭菌备用.4.6 兔（人）血浆制备kPa (121℃15lb)30min高压灭菌，1份加兔（人）全血4份，混匀静置；2000rpm～3000rpm离心3min～5min.血球下沉，取上面血浆.5.1 增菌：取1：10稀释的样品接种到90mL SCDLP液体造就基中，置36℃±1℃造就箱，造就24h±2h.注：如无此造就基也可用7.5%氯化钠肉汤.5.2 分别：自上述增菌造就液中，取1～2接种环，划线接种在Baird Parker氏造就基，如无此造就基也可划线接种到血琼脂平板，置36℃±1℃造就箱造就24h～48h.在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，概况滑腻，周围有溶血圈.在Baird Parker氏造就基上为圆形，滑腻，凸起，湿润，直径2mm～3mm,颜色呈灰色到黑色，边沿为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带.用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度.有时会遇到非脂肪溶解的相似菌落，但无混浊带及透明带.挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36℃±1℃造就24h±2h.μm～1μm.5.4 甘露醇发酵试验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵造就基中，在造就基液面上参加2mm～3mm高的灭菌液体石蜡，置36℃±1℃造就箱造就24h ±2h,金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸.5.5 血浆凝固酶试验：吸取1：4新鲜血浆0.5mL,放入灭菌小试管中，参加待检菌24h±2h肉汤造就物0.5mL.混匀，放36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半个小时不雅察一次，6h之内如呈现凝块即为阳性.同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤造就物及肉汤造就基各0.5mL,分别参加灭菌1：4血浆0.5mL,混匀，作为对比.凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，可陈述被检样品检出金黄色葡萄球菌.六、霉菌和酵母菌本规范划定了化装品中霉菌和酵母菌的磨练办法.本规范适用于各类化装品中霉菌和酵母菌的计数.本规范采取下列界说霉菌和酵母菌数测定（Determination of molds and yeast count）是指化装品检样在一定条件下造就后，1g或1mL化装品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化装品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况.本办法依据霉菌和酵母菌特有的形态和造就特性，在虎红造就基上，置28℃±2℃造就72h,盘算所生长的霉菌和酵母菌数.3.1 造就箱：28℃±2℃.3.2 振荡器.3.3 天平.3.4 三角瓶，250mL.3.5 试管：15×150mm.3.6 平皿：直径9cm.3.7 吸管，1mL、10mL.3.8 量筒，200mL.3.9 酒精灯.3.10 高压灭菌器.4.1 生理盐水见总则中3.1.4.2 虎红（孟加拉红）造就基成分：蛋白胨 5g葡萄糖 10g磷酸二氢钾 1g硫酸镁（含7H2琼脂 20g1/3000虎红溶液（四氯四碘荧光素） 100mL蒸馏水 1000mL氯霉素 100mgkPa (121℃ 15lb)20min高压灭菌，另用少量乙醇溶解氯霉素，过滤溶解后参加造就基中，若无氯霉素，使用时每1000mL加链霉素30mg.5.1 样品稀释见总则中供检样品的制备.5.2 取1：10、1：100、1：1000的检液各1mL分别注入灭菌平皿内，每个稀释度各用2个平皿，注入融化并冷至45℃±1℃左右的虎红造就基，充分摇匀.凝固后，翻转平板，置28℃±1℃造就72h±2h,计数平板内生长的霉菌和酵母菌数.若有霉菌舒展生长，为防止影响其它霉菌和酵母菌的计数时，于48h ±2h应实时将此平板取出计数.5.3 盘算办法：先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数.剖断成果时，应选取菌落数在5个～50个规模之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每g（或每mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数.其它规模内的菌落数陈述应参照菌落总数的陈述办法陈述之.5.4 每g（或每mL）化装品含霉菌和酵母菌数以CFU/g(mL)暗示.。
化妆品的微生物五项检测
化妆品的微生物五项检测化妆品检测哪些微生物项目及检测方法？微生物五项：菌落总数，霉菌与酵母菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，耐热大肠杆菌检测方法：《化妆品安全技术规范》2015版。
菌落总数：《化妆品安全技术规范》2015版中第五章的2 菌落总数检验方法1 范围本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。
本规范适用于化妆品菌落总数的测定。
2 定义2.1 菌落总数Aerobic bacterial count化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。
所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性和兼性厌氧菌落总数。
测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。
霉菌与酵母菌：《化妆品安全技术规范》2015版中第五章的6 霉菌和酵母菌检验方法1 范围本规范规定了化妆品中霉菌和酵母菌数的检测方法。
本规范适用于化妆品中霉菌和酵母菌的测定。
2 定义2.1 霉菌和酵母菌数测定化妆品检样在一定条件下培养后，1g 或1mL 化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。
本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28℃±2℃培养5分钟，计算所生长的霉菌和酵母菌数。
金黄色葡萄球菌：《化妆品安全技术规范》2015版中第五章的5 金黄色葡萄球菌检验方法1 范围本规范规定了化妆品中金黄金色葡萄球菌的检验方法。
本规范适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检验。
2 定义2.1 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。
铜绿假单胞菌：《化妆品安全技术规范》2015版中第五章的4 铜绿假单胞菌检验方法1 范围本规范规定了化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法。
本规范适用于化妆品中铜绿假单胞菌的检验。
浅析微生物检验在化妆品检验中的应用
浅析微生物检验在化妆品检验中的应用目的：研究分析日常化妆品中微生物的污染情况以及微生物在化妆品检验中的应用情况。
方法：对商场上比较常见的化妆品进行抽样检验，共抽取150份样品，对样品中的菌落总数、金黄色葡萄球菌、粪大肠菌群、酵母菌以及霉菌等微生物进行检验。
结果：使用前采样化妆品微生物的合格率为98%，当使用30天后以及60天后的化妆品，微生物的合格率会随着使用时间的延长而逐渐降低。
结论：化妆品在使用的过程中，具有二次污染情况，使用的时间越长，其污染的越严重。
因此，需要正视微生物检验在化妆品检验中的积极作用，针对当前存在的问题进行分析研究，制定出相关解决措施，并做好检验工作。
标签：微生物；检验；化妆品；应用微生物的指标和化妆品的质量具有紧密的联系，其中微生物的指标会危害到化妆品消费者的健康和安全。
目前，微生物指标对化妆品的影响逐渐受到各界的关注，各个国家分别制定出化妆品的微生物指标，以便有效的确保化妆品的产品不受污染，从而有效的提高化妆品的质量，保护消费者的合法权益[1]。
因此，微生物检验在化妆品检验中的应用越来越广泛，其应用价值越来越高。
随着我国化妆品行业的快速发展，微生物检验在化妆品检验中发挥着越来越重要的作用[2]。
本研究通过对150个化妆品样品进行微生物检验分析，现报告如下。
1.资料与方法1.1一般资料选取市场上比较常见的化妆品，随机抽取化妆品生产商和销售商，对抽样的150份样品进行检验，所有的样品均符合检验卫生标准要求，均在保质期以内。
对150份样品进行使用前、使用30天和使用60天后微生物检验。
1.2方法其一，检测的项目。
对150份化妆样品中的菌落数进行检验，主要包括菌落总数、金黄色葡萄球菌、霉菌、粪大肠菌群、铜绿假单胞菌以及酵母菌等。
其二，检测方式和评价标准。
根据《化妆品卫生规范》中的相关标准要求进行检测，其中6项指标中的任何一项超出卫生标准，表示该化妆品不合格。
2.结果针对本次抽样检查的150份化妆样品中，检验结果显示：（1）使用前。
化妆品微生物检验方法
一、总则1.范围本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。
2.仪器和设备2.1 天平。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶，250mL。
2.5 玻璃珠。
2.6 琉璃棒。
2.7 刻度吸管，1mL、10mL。
2.8 研钵或均质器。
2.9 恒温水浴箱。
3.培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠 8.5g蒸馏水加至 1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90 mL，103.43kPa (121℃ 15 lb)20min高压灭菌。
3.2 SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖 1g吐温80 7g蒸馏水 1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3分装，103.43 kPa (121℃ 15 lb)20min高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
3.4 灭菌吐温80。
4.样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。
包装量小于20g的样品，采样量可适当增加样品包装数量。
4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
化妆品微生物标准检验方法总则及注解
化妆品微生物标准检验方法总则及注解中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法 UDC 668：576 .85.07总则 (GB7918.1－87)Standard methods of microbiological examination for cosmeticsGeneral rules1 样品的采集及注意事项1.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10ml。
包装量小的样品，取样量可酌减。
1.2 供检样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得启开，以防再污染。
1.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放不室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
1.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品作细菌检验，再将剩余样品作其他分析。
1.5 在检验过程中，从开封到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行。
或在相应条件下，按无菌操作规定进行。
1.6 如检出烘大肠菌群或其他致病菌，自报告发出起该菌种及被检样品应保存一个月备查。
2 供检样品的制备2.1 培养基和试剂2.1.1 生理盐水氯化钠8.5g蒸馏水1000ml溶解后，分装到加玻璃珠的锥形瓶内，每瓶90ml，121℃(15 1b)20min高灭菌。
2.1.2 SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖 2.5g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000ml制法：将上述成分混合后，加热溶解，凋pH为7.2～7.3分装，121℃(15 1b)20min 高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用日本多胨代替。
化妆品微生物检验方法
一、总则之相礼和热创作本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求.本规范适用于化妆品样品的网络、保管及供检样品制备.2.1 天平.2.2 高压灭菌器.2.3 振荡器.2.4 三角瓶，250mL.2.5 玻璃珠.2.6 琉璃棒.2.7 刻度吸管，1mL、10mL.2.8 研钵或均质器.2.9 恒温水浴箱.3.1 生理盐水成分：蒸馏水加至 1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90mL，103.43kPa(121℃15lb)20min高压灭菌.3.2 SCDLP液体培育基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化钠 5g葡萄糖 1g吐温80 7g蒸馏水1000mL～7.3分装，103.43kPa(121℃ 15lb)20min高压灭菌.留意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右运用.注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替.3.3灭菌液体石蜡.3.4灭菌吐温80.4.1 所网络的样品，应具有代表性，一样平常视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位.检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g 或10mL.包装量小于20g的样品，采样量可得当添加样品包装数量.4.2 供检验样品，应严厉坚持原有的包装形状.容器不该有决裂，在检验前不得打开，防止样品被净化.4.3 接到样品后，应马上登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验.如不克不及及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻.4.4 若只要一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做别的分析.4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操纵结束，均须防止微生物的再净化和扩散，所用器皿及材料均应事前灭菌，全部操纵应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操纵规定进行.4.6如检出粪大肠菌群或别的致病菌，自陈述发出之日起该菌种及被检样品应保管一个月.5.1 液体样品5.1.1 水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按10倍浓缩法进行.如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后制成1：10检液.5.1.2 油性液体样品，取样品10mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加10mL 灭菌的吐温80,在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10检液.5.3 固体样品称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1：10的检液.如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质1min～2min；疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称10g样品，加入10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80,70mL灭菌生理盐水，均质3min～5min.二、菌落总数本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法.本规范适用于化妆品菌落总数的测定.本规范采取下列定义菌落总数（Aerobic bacterial count）是指化妆品检样经过处理，在肯定条件下培育后（如培育基成分、培育温度、培育工夫、pH值、需氧性子等），1g(1mL)检样中所含菌落的总数.所得结果只包含一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数.测定菌落总数便于判明样品被细菌净化的程度，是对样品进行卫生总评价的综合根据.3.1 三角瓶，250mL.3.2 量筒，200mL.3.3 pH计或周密pH试纸.3.4 高压灭菌器.3.5 试管：15×150mm.3.6 灭菌平皿：直径9cm.3.7 灭菌刻度吸管，10mL、1mL.3.8 酒精灯.3.9 恒温培育箱：36℃±1℃.3.10 放大镜.4.1 生理盐水：见总则中3.1.4.2 卵磷脂、吐温80-养分琼脂培育基4.2.1成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g卵磷脂 1g吐温80 7g蒸馏水 1000mL4.2.2 制法：先将卵磷脂加到大批蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80,将其他成分（除琼脂外）加到别的的蒸馏水中，溶解.加入已溶解的卵磷脂、吐温80,混匀，调pH值为7.1～7.4,加入琼脂，103.43kPa(121℃ 15lb)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用.4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC）成分：蒸馏水 1000mL溶解后过滤，103.43kPa (121℃15lb)20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4℃冰箱备用.5.1 用灭菌吸管汲取1：10浓缩的检液2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL.另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中（留意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1：100检液.汲取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL.如样品含菌量高，还可再浓缩成1：1000,1：10000，……等，每种浓缩度应更换1支吸管.5.2 将消融并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐温80养分琼脂培育基倾注到平皿内，每皿约15mL,随即转动平皿，使样品与培育基充分混合均匀，待琼脂凝结后，翻转平皿，置36℃±1℃培育箱内培育48h±2h.另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80养分琼脂培育基，待琼脂凝结后，翻转平皿，置36℃±1℃培育箱内培育48h±2h，为空白对照.5.3 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80养分琼脂中加入1mL 0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培育后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变更.6．菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5倍～10倍的放大镜检查，以防脱漏.记下各平皿的菌落数后，求出同一个浓缩度各平皿生长的均匀菌落数.若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数.若片状菌落不到平皿中的一半，而别的一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2,以代表全皿菌落数.7.1 首先选取均匀菌落数在30个～300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围.当只要一个浓缩度的均匀菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其浓缩倍数（见表1中例1）.7.2 若有两个浓缩度，其均匀菌落数均在30个～300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2,应陈述其均匀数，若大于2则陈述其中浓缩度较低的平皿的菌落数（见表1中例2及例3）.7.3 若全部浓缩度的均匀菌落数均大于300个，则应按浓缩度最高的均匀菌落数乘以浓缩倍数陈述之（见表1中例4）.7.4 若全部浓缩度的均匀菌落数均小于30个，刚应按浓缩度最低的均匀菌落数乘以浓缩倍数陈述之（见表1中例5）.7.5 若全部浓缩度的均匀菌落数均不在30个～300个之间，其中一个浓缩度大于300个，而相邻的另一浓缩度小于30个时，则以30或300的均匀菌落数乘以浓缩倍数陈述之（见表1中例6）.7.6 若全部的浓缩度均无菌生长，陈述数为每g或每mL小于10 CFU.7.7 菌落计数的陈述，菌落数在10以内时，按实无数值陈述之，大于100时，采取二位无效数字，在二位无效数字后面的数值，应以四舍五入法计算.为了延长数字后面零的个数，可用10的指数来暗示（见表1陈述方式栏）.在陈述菌落数为“不成计”时，应注明样品的浓缩度.表1 细菌计数结果及陈述方式例次分歧浓缩度均匀菌落数两浓缩度菌数之比菌落总数(CFU/mL或CFU/g）陈述方式(CFU/mL或CFU/g）10-110-210-31 1365 164 20 ——16400 ×1042 2760 295 46 38000 ×1043 2890 271 60 27100 ×1044 不成计4650 513 ——513000 ×1055 27 11 5 ——270 ×1026 不成计305 12 ——30500 ×1047 0 0 0 ——＜1×10 ＜1×10*CFU：菌落构成单位.三、粪大肠菌群本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法.本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验.本规范采取下列定义粪大肠菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44℃±℃培育24h～48h能发酵乳糖产酸并产气.该菌直接来自粪便，是紧张的卫生目标菌.3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44℃±℃.3.2 温度计.3.3 显微镜.3.4 载玻片.3.5 接种环.3.6 电磁炉.3.7 三角瓶，250mL.3.8 试管：15×150mm.3.9 小倒管.3.10 pH计或pH试纸.3.11 高压灭菌器.3.12 灭菌吸管，10mL、1mL.3.13 灭菌平皿：直径90mm.4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培育基成分：蛋白胨 40g猪胆盐 10g乳糖 10g0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL卵磷脂 2g吐温80 14g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10lb)20min高压灭菌.4.2 伊红美蓝（EMB）琼脂成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 20g2%伊红水溶液 20mL0.5%美蓝水溶液 13mL蒸馏水 1000mLkPa (121℃15lb)15min高压灭菌备用.临用时加入乳糖并加热消融琼脂.冷至60℃左右无菌操纵加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀.倾注平皿备用.4.3 蛋白胨水（做靛基质实验用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g氯化钠 5g蒸馏水 1000mLkPa (121℃ 15lb)15min高压灭菌.4.4 靛基质试剂柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL.实验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44℃±℃培育24h±2h.沿管壁加柯凡克试剂0.3mL～0.5mL，轻摇试管.阳性者于试剂层显深玫瑰红色.注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可运用.4.5 革兰氏染色液：4.5.1 染液制备4.5.1.1 结晶紫染色液：结晶紫 1g95%乙醇 20mL1%草酸铵水溶液 80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合.4.5.1.2 革兰氏碘液：碘 1g碘化钾 2g蒸馏水加至 300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL.4.5.1.3 脱色液：95%乙醇.4.5.1.4 复染液：（1）沙黄复染液：95%乙醇 10mL蒸馏水 90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水浓缩.（2）稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100mL,放置过夜，滤纸过滤.取该液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL,混合，即为石碳酸复红液.再取此液10mL加水90mL,即为稀石碳酸复红液.4.5.2 染色法4.5.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗.4.5.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗.4.5.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s,或将乙醇滴满整个涂片，马上倾往，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s,水洗.4.5.2.4 滴加复染液，复染1min,水洗，待干，镜检.4.5.3 染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色.注：如用1：10浓缩石碳酸复红液做复染，复染工夫仅需10s.5.1 取10mL 1：10浓缩的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培育基中，置44℃±℃培育箱中培育24h～48h，如不产酸也不产气，则陈述为粪大肠菌群阴性.5.2 如产酸产气，则划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培育18h～24h.同时取该培育液1～2滴接种到蛋白胨水中，置44℃±℃培育24h±2h.经培育后，在上述平板上观察有无典型菌落生长.粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培育基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边沿划一，概况光滑潮湿，常具有金属光泽.也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应留意挑选.5.3 挑取上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检.5.4 在蛋白胨水培育液中，加入靛基质试剂约0.5mL,观察靛基质反应.阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂赋性.根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证明为革兰氏阴性杆菌，靛基质实验阳性，则可陈述被检样品中检出粪大肠菌群.四、铜绿假单胞菌本规范规定了化妆品中铜绿假单胞菌的检验方法.本规范适用于化妆品中铜绿假单胞菌的检验.本规范采取了下列定义铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能发生绿脓菌素.此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃±1℃条件下能生长.该菌对人有致病力，可使伤处化脓，惹起败血症等.3.1 培育箱：42℃±1℃、36℃±1℃.3.2 三角瓶，250mL.3.3 试管：15×150mm.3.4 灭菌平皿：直径90mm.3.5 灭菌刻度吸管，10mL、1mL.3.6 显微镜.3.7 载玻片.3.8 接种针，接种环.3.9 电磁炉.3.10 高压灭菌器.4.1 SCDLP 液体培育基见总则中3.2.4.2 十六烷基三甲基溴化铵培育基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 10g氯化钠 5g琼脂 20g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10lb)20min灭菌后，制成平板备用.4.3 乙酰胺培育基成分：硫酸镁（MgSO4.7H2琼脂 20g蒸馏水 1000mL制法：除琼脂和酚红外，将别的成分加到蒸馏水中，加热溶解，调kPa (121℃15lb)20min高压灭菌后，制成平板备用.4.4 绿脓菌素测定用培育基成分：蛋白胨 20g硫酸钾 10g琼脂 18g甘油（化学纯） 10g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用.4.5 明胶培育基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 5g明胶 120g蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min高压灭菌后，直立制成高层备用.4.6 硝酸盐蛋白胨水培育基成分：蛋白胨 10g酵母浸膏 3g硝酸钾 2g亚硝酸钠 0.5g蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调kPa (115℃10 lb)20min高压灭菌后备用.4.7 平凡琼脂斜面培育基成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 5g琼脂 15g蒸馏水 1000mLkPa (121℃ 15lb)20min高压灭菌后，制成斜面备用.5.操纵步调5.1 增菌培育：取1：10样品浓缩液10mL加到90mLSCDLP液体培育基中，置36℃±1℃培育18h～24h.如有铜绿假单胞菌生长，培育液概况多有一层薄菌膜，培育液常呈黄绿色或蓝绿色.5.2 分离培育：从培育液的薄膜处挑取培育物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置36℃±1℃培育18h～24h.凡铜绿假单胞菌在此培育基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略在蔓延，概况潮湿，菌落呈灰白色，菌落四周培育基常扩散有水溶性色素，此培育基选择性强，大肠埃希氏菌不克不及生长，革兰氏阳性菌生长较差.在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培育基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置36℃±1℃培育24h±2h，铜绿假单胞菌在此培育基上生长良好，菌落扁平，边沿不整，菌落四周培育基略带粉红色，别的菌落不生长.5.3 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶实验.5.4 氧化酶实验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸上，然后在其上滴加一新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15s～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶实验阳性；若培育物不变色，为氧化酶实验阴性.5.5 绿脓菌素实验：取可疑菌落2个～3个，分别接种在绿脓菌素测定培育基上，置36℃±1℃培育24h±2h,加入氯仿3mL～5mL,充分振荡使培育物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻.如下层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，暗示被检物中有绿脓菌素存在.5.6 硝酸盐还原产气实验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培育物，接种在硝酸盐蛋白胨水培育基中，置36℃±1℃培育24h±2h,观察结果.凡在硝酸盐蛋白胨水培育基内的小倒管中有气体者，即阳性，标明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解发生氮气.5.7 明胶液化实验，取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培育物，穿刺接种在明胶培育基内，置36℃±1℃培育24h±2h,取出放冰箱10min～30min,如仍呈溶解状或概况溶解时即为明胶液化实验阳性；如凝结不溶者为阴性.5.8 42℃生长实验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培育物，接种在平凡琼脂斜面培育基上，放在42℃±1℃培育箱中，培育24h～48h,铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不克不及生长.被检样品经增菌分离培育后，经证明为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素实验皆为阳性者，即可陈述被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素实验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长实验三者皆为阳性时，仍可陈述被检样品中检出铜绿假单胞菌.五、金黄色葡萄球菌本规范规定了化妆品中金黄色葡萄球菌的检验方法.本规范适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检验.本规范采取下列定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状陈列，无芽孢，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝结酶阳性.该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能惹起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症.3.1 显微镜.3.2 恒温培育箱：36℃±1℃.3.3 离心机.3.4 灭菌吸管，1mL、10mL.3.5 灭菌试管：15×150mm.3.6 载玻片.3.7 酒精灯.4.1 SCDLP液体培育基见总则中3.2.4.2 7.5%的氯化钠肉汤成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 75g蒸馏水加至 1000mLkPa (121℃ 15lb)15min 高压灭菌. 4.3 Baird Parker 氏培育基成分：胰蛋白胨 10g牛肉膏 5g酵母浸膏 1g丙酮酸钠 10g甘氨酸 12g氯化锂（LiCl·6H2O） 5g琼脂 20g蒸馏水 950mL±增菌剂的配制：30%卵黄盐水50mL与除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保管于冰箱内.制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃±1℃kPa (121℃15lb)高压灭菌15min.临用时加热溶化琼脂，每95mL加入预热至50℃左右的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平板.培育基应是致密不通明的.运用前在冰箱储存不得超出48h±2h.4.4 血琼脂培育基成分：养分琼脂 100mL脱纤维羊血（或兔血） 10mL制法：将养分琼脂加热消融，待冷至50℃左右无菌操纵加入脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用.4.5 甘露醇发酵培育基成分：蛋白胨 10g氯化钠 5g甘露醇 10g牛肉膏 5g0.2%麝香草酚蓝溶液 12mL蒸馏水 1000mLkPa (115℃ 10 lb)20min灭菌备用.4.6 兔（人）血浆制备kPa (121℃15lb)30min高压灭菌，1份加兔（人）全血4份，混匀静置；2000rpm～3000rpm离心3min～5min.血球下沉，取下面血浆.5.1 增菌：取1：10浓缩的样品接种到90mL SCDLP液体培育基中，置36℃±1℃培育箱，培育24h±2h.注：如无此培育基也可用7.5%氯化钠肉汤.5.2 分离：自上述增菌培育液中，取1～2接种环，划线接种在Baird Parker 氏培育基，如无此培育基也可划线接种到血琼脂平板，置36℃±1℃培育箱培育24h～48h.在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不通明，概况光滑，四周有溶血圈.在Baird Parker氏培育基上为圆形，光滑，凹陷，潮湿，直径2mm～3mm,颜色呈灰色到黑色，边沿为淡色，四周为一混浊带，在其外层有一通明带.用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度.偶尔会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及通明带.挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置36℃±1℃培育24h±2h.μm～1μm.5.4 甘露醇发酵实验：取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培育基中，在培育基液面上加入2mm～3mm高的灭菌液体石蜡，置36℃±1℃培育箱培育24h±2h,金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸.5.5 血浆凝结酶实验：汲取1：4奇怪血浆0.5mL,放入灭菌小试管中，加入待检菌24h±2h肉汤培育物0.5mL.混匀，放36℃±1℃恒温箱或恒温水浴中，每半个小时观察一次，6h之内如呈现凝块即为阳性.同时以已知血浆凝结酶阳性和阴性菌株肉汤培育物及肉汤培育基各0.5mL,分别加入灭菌1：4血浆0.5mL,混匀，作为对照.凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸，血浆凝结酶实验阳性者，可陈述被检样品检出金黄色葡萄球菌.六、霉菌和酵母菌本规范规定了化妆品中霉菌和酵母菌的检验方法.本规范适用于各种化妆品中霉菌和酵母菌的计数.本规范采取下列定义霉菌和酵母菌数测定（Determination of molds and yeast count）是指化妆品检样在肯定条件下培育后，1g或1mL化妆品中所净化的活的霉菌和酵母菌数量，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌净化程度及其一样平常卫生情况.本方法根据霉菌和酵母菌特有的形状和培育特性，在虎红培育基上，置28℃±2℃培育72h,计算所生长的霉菌和酵母菌数.3.1 培育箱：28℃±2℃.3.2 振荡器.3.3 天平.3.4 三角瓶，250mL.3.5 试管：15×150mm.3.6 平皿：直径9cm.3.7 吸管，1mL、10mL.3.8 量筒，200mL.3.9 酒精灯.3.10 高压灭菌器.4.1 生理盐水见总则中3.1.4.2 虎红（孟加拉红）培育基成分：蛋白胨 5g葡萄糖 10g磷酸二氢钾 1g硫酸镁（含7H2琼脂 20g1/3000虎红溶液（四氯四碘荧光素） 100mL蒸馏水 1000mL氯霉素 100mgkPa (121℃ 15lb)20min高压灭菌，另用大批乙醇溶解氯霉素，过滤溶解后加入培育基中，若无氯霉素，运用时每1000mL加链霉素30mg.5.1 样品浓缩见总则中供检样品的制备.5.2 取1：10、 1：100、 1：1000的检液各1mL分别注入灭菌平皿内，每个浓缩度各用2个平皿，注入消融并冷至45℃±1℃左右的虎红培育基，充分摇匀.凝结后，翻转平板，置28℃±1℃培育72h±2h,计数平板内生长的霉菌和酵母菌数.若有霉菌蔓延生长，为防止影响别的霉菌和酵母菌的计数时，于48h±2h应及时将此平板取出计数.5.3 计算方法：先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个浓缩度的均匀菌落数.断定结果时，应选取菌落数在5个～50个范围之内的平皿计数，乘以浓缩倍数后，即为每g（或每mL）检样中所含的霉菌和酵母菌数.别的范围内的菌落数陈述应参照菌落总数的陈述方法陈述之.5.4 每g（或每mL）化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g(mL)暗示.。
化妆品微生物检验方法
一、总则1.范围本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。
本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。
2.仪器和设备2.1 天平。
2.2 高压灭菌器。
2.3 振荡器。
2.4 三角瓶，250mL。
2.5 玻璃珠。
2.6 琉璃棒。
2.7 刻度吸管，1mL、10mL。
2.8 研钵或均质器。
2.9 恒温水浴箱。
3.培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠8.5g蒸馏水加至1000mL溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，每瓶90 mL，103.43kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。
3.2 SCDLP液体培养基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化钠5g磷酸氢二钾 2.5g葡萄糖1g吐温80 7g蒸馏水1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合，加热溶解，调pH为7.2～7.3分装，103.43 kPa (121℃15 lb)20min高压灭菌。
注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至25℃左右使用。
注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。
3.3 灭菌液体石蜡。
3.4 灭菌吐温80。
4.样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。
检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。
包装量小于20g的样品，采样量可适当增加样品包装数量。
4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。
容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。
4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。
如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。
4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩余样品做其它分析。
4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。