2-凝胶层析课件
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生物制药工艺学课件讲稿—凝胶层析
第七章凝胶层析定义：将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组份得以分离的层析（色谱）方法，又叫扩散层析，排阻层析，分子筛层析第一节基本原理一.分离原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。
一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
凝胶层析分离的基本原理如下：凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。
第——部分是全排阻分子，也可称之为上限分子，是不能起筛分作用的大分子。
第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效分离的分子。
第三部分是全渗透分子，称之为下限分子，是不能起筛分作用的小分子。
如图2—27所示。
从图2—27可以看出，A—B之间为该凝胶的有效分离范围．可分离相对分子质量范围是103一105，高于相对分子质量为105的是全排阻分子，低于相对分子质量为105的是全渗透分子。
二.参数的表示方法及其意义1.表示方法(1)柱床体积凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(totle volume)表示，单位为m1。
(2)外水体积存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那—部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积、空隙体积，以Vo(outer volume)表示，单位为ml(3)内水体积是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积，以V i(inner volume)表示，单位为ml。
(4)凝胶体积是凝胶颗粒自身的体积．也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积，以Vg(gel volume)表示，单位为ml。
《凝胶层析法》课件
改进方向
提高分离速度
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法的分离速度。
减少小分子物质的损失
研究新型的凝胶介质和操作条件，减少小分 子物质的损失。
增强对大分子的分离效果
开发新型凝胶介质，提高对大分子物质的分 辨率。
提高温度稳定性
通过改进凝胶介质或优化操作条件，提高凝 胶层析法对温度变化的稳定性。
装柱
将凝胶颗粒装入层析柱中，确 保填充均匀。
上样
将待分离样品加入层析柱的顶 部，确保样品与凝胶颗粒充分 接触。
检测
对洗脱液进行检测，观察分离 效果。
结果分析
对收集到的洗脱液进行定性和定量分 析，确定各组分的含量和纯度。
比较实验结果与预期结果，分析实验 误差和影响因素，总结实验结论。
03
CATALOGUE
告撰写非常重要。
采用适当的统计方法处理数据
对于实验数据，应采用适当的统计方法进行处理和分析， 以得出可靠的结论。
备份实验数据
为了防止数据丢失，应将实验数据备份并保存在安全的地 方。
04
CATALOGUE
凝胶层析法实验案例
实验一：分离蛋白质
总结词
通过凝胶层析法分离蛋白质，可以获得高纯度的蛋白质样品，为后续的生化分析提供高 质量的原料。
原理
基于分子大小和形状差异，利用凝胶孔径对不同大小分子进行选择性分离，大 分子不能进入凝胶孔洞，而小分子可以进入凝胶孔洞，从而实现大小分子的分 离。
发展历程
起源
现状
凝胶层析法起源于20世纪40年代，最 初用于蛋白质的分离。
目前，凝胶层析法已成为一种广泛应 用于分离纯化技术领域的进和分离技术 的提高，凝胶层析法逐渐应用于更多 领域，如生物技术、制药、环境科学 等。
凝胶过滤层析ppt课件
标准曲线
Ve
log M
凝胶过滤层析的特点
优点：
操作条件温和，样品回收率可接近100％，并且重复性高。
作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白 活性收率高；
分离机理简单，操作参数少，容易规模放大
缺点：
分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离
料液处理量小，并且样品粘度不宜太高
内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
葡聚糖凝胶
➢ 葡聚糖凝胶（Sephadex）具有 良好的化学稳定性，是目前生 化产品制备中最常用的凝胶。
Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 <700 D G15 <1,500 G25 1,000 ~ 5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞
作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱 中的迁移速度不同得到分离。
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
小分子 被延滯
较快流出
基本概念
外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒 间液体流动相的体积。
样品的浓度：样品浓度以不大于4 ％为宜，样品浓度过大往往导致粘 度增大。如果样品浑浊，应先过滤 或离心除去颗粒后上柱
Ve
log M
凝胶过滤层析的特点
优点：
操作条件温和，样品回收率可接近100％，并且重复性高。
作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白 活性收率高；
分离机理简单，操作参数少，容易规模放大
缺点：
分辨率不高，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离
料液处理量小，并且样品粘度不宜太高
内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。 基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
葡聚糖凝胶
➢ 葡聚糖凝胶（Sephadex）具有 良好的化学稳定性，是目前生 化产品制备中最常用的凝胶。
Sephadex G系列凝胶的分级范围 G10 <700 D G15 <1,500 G25 1,000 ~ 5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞
作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱 中的迁移速度不同得到分离。
小分子
固 定 相
样品
流 动 相
大分子
小分子 被延滯
较快流出
基本概念
外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒 间液体流动相的体积。
样品的浓度：样品浓度以不大于4 ％为宜，样品浓度过大往往导致粘 度增大。如果样品浑浊，应先过滤 或离心除去颗粒后上柱
凝胶层析(生化实验)PPT课件
Proteins that are applied will migrate until the pH = pI, then they will cease to migrate
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Electrophoresis
Electrophoresis is an analytic method to analyze the purity of proteins. It is can also be used to estimate molecular weight of proteins.
生物大分子的分离生物大分子的分离凝胶层析分离蛋白质凝胶层析分离蛋白质生物化学实验生物化学实验上海交通大学生命科学技术学院上海交通大学生命科学技术学院实验目的实验目的了解凝胶柱层析的原理及应用掌握凝胶柱层析的基本操作技术进一步了解和掌握其他层析技术purificationmultistepprocedure
上海交通大学生命科学技术学院
生物化学实验
生物大分子的分离 —— 凝胶层析分离蛋白质
实验目的
1. 了解生物大分子分离、纯化的方法 2. 了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝
胶柱层析的基本操作技术 3. 进一步了解和掌握其他层析技术
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2
Purification is a multi-step procedure.
1. Dialysis and ultrafiltration 2. Gel electrophoresis 3. Gel filtration chromatography 4. Ultracentrifugation
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Electrophoresis
Electrophoresis is an analytic method to analyze the purity of proteins. It is can also be used to estimate molecular weight of proteins.
生物大分子的分离生物大分子的分离凝胶层析分离蛋白质凝胶层析分离蛋白质生物化学实验生物化学实验上海交通大学生命科学技术学院上海交通大学生命科学技术学院实验目的实验目的了解凝胶柱层析的原理及应用掌握凝胶柱层析的基本操作技术进一步了解和掌握其他层析技术purificationmultistepprocedure
上海交通大学生命科学技术学院
生物化学实验
生物大分子的分离 —— 凝胶层析分离蛋白质
实验目的
1. 了解生物大分子分离、纯化的方法 2. 了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝
胶柱层析的基本操作技术 3. 进一步了解和掌握其他层析技术
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Purification is a multi-step procedure.
1. Dialysis and ultrafiltration 2. Gel electrophoresis 3. Gel filtration chromatography 4. Ultracentrifugation
《凝胶层析技术》课件
样品上样
将过滤后的样品加入层析柱中，确保样品均匀分布在凝胶颗 粒表面。
洗脱与分离
01
02
03
洗脱液的选择
根据待分离组分的性质选 择合适的洗脱液，如缓冲 液、有机溶剂等。
洗脱速度的控制
根据分离效果和分离时间 的要求，调整洗脱液的流 速。
洗脱分馏
通过控制洗脱液的流速和 组分的吸附特性，使不同 组分依次从凝胶层析柱中 洗脱出来。
蛋白质分离
凝胶层析技术可用于分离和纯化 蛋白质，通过凝胶颗粒的孔径大 小和电荷性质，将不同大小的蛋
白质分子进行分离。
去除杂质
凝胶层析技术可以用于去除蛋白质 样品中的杂质，如盐、DNA、 RNA等，提高蛋白质的纯度。
蛋白质定量
凝胶层析技术还可以用于蛋白质的 定量分析，通过测量洗脱液中蛋白 质的浓度，计算蛋白质的含量。
高分辨率与高灵敏度
为了满足更精细的分离需求，凝胶层析技术将向 高分辨率和高灵敏度方向发展。这需要研发新型 凝胶介质和优化分离条件，以提高分离效果。
多功能化与集成化
随着应用领域的拓展，凝胶层析技术将向多功能 化和集成化方向发展。这包括与其他分离技术的 结合，以及在微流控芯片上的集成应用，以满足 复杂样品处理的需求。
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的进步，凝胶层析技 术的自动化和智能化将成为未来的重要发展趋势 。这不仅可以提高分离效率，减少人为误差，还 能大幅减少人力成本。
高通量与快速分离
高通量和快速分离是凝胶层析技术的另一重要发 展趋势。通过改进凝胶介质和优化分离流程，可 以实现更高流速下的高效分离，缩短分离时间。
凝胶的清洗与再生
清洗
在每次使用后，用适量的 溶剂清洗凝胶层析柱，去 除残留的杂质和洗脱液。
将过滤后的样品加入层析柱中，确保样品均匀分布在凝胶颗 粒表面。
洗脱与分离
01
02
03
洗脱液的选择
根据待分离组分的性质选 择合适的洗脱液，如缓冲 液、有机溶剂等。
洗脱速度的控制
根据分离效果和分离时间 的要求，调整洗脱液的流 速。
洗脱分馏
通过控制洗脱液的流速和 组分的吸附特性，使不同 组分依次从凝胶层析柱中 洗脱出来。
蛋白质分离
凝胶层析技术可用于分离和纯化 蛋白质，通过凝胶颗粒的孔径大 小和电荷性质，将不同大小的蛋
白质分子进行分离。
去除杂质
凝胶层析技术可以用于去除蛋白质 样品中的杂质，如盐、DNA、 RNA等，提高蛋白质的纯度。
蛋白质定量
凝胶层析技术还可以用于蛋白质的 定量分析，通过测量洗脱液中蛋白 质的浓度，计算蛋白质的含量。
高分辨率与高灵敏度
为了满足更精细的分离需求，凝胶层析技术将向 高分辨率和高灵敏度方向发展。这需要研发新型 凝胶介质和优化分离条件，以提高分离效果。
多功能化与集成化
随着应用领域的拓展，凝胶层析技术将向多功能 化和集成化方向发展。这包括与其他分离技术的 结合，以及在微流控芯片上的集成应用，以满足 复杂样品处理的需求。
自动化与智能化
随着机器人技术和人工智能的进步，凝胶层析技 术的自动化和智能化将成为未来的重要发展趋势 。这不仅可以提高分离效率，减少人为误差，还 能大幅减少人力成本。
高通量与快速分离
高通量和快速分离是凝胶层析技术的另一重要发 展趋势。通过改进凝胶介质和优化分离流程，可 以实现更高流速下的高效分离，缩短分离时间。
凝胶的清洗与再生
清洗
在每次使用后，用适量的 溶剂清洗凝胶层析柱，去 除残留的杂质和洗脱液。
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友情提醒
（1）、在装柱的同时应接通各仪器电源进行预热，并按要求不 ）、在装柱的同时应接通各仪器电源进行预热， 在装柱的同时应接通各仪器电源进行预热 断调试各仪器。 断调试各仪器。 （2）、在柱子平衡时，应将柱下端出口与紫外检测仪进口端相 ）、在柱子平衡时， 在柱子平衡时 连接，由紫外检测仪出口端流出，并在此条件下， 连接，由紫外检测仪出口端流出，并在此条件下，进行 仪器零点调节。 仪器零点调节。 （3）、在开始上样之前，必须事先启动控制工作站的电脑。 ）、在开始上样之前，必须事先启动控制工作站的电脑。 在开始上样之前
（1）、 电 脑 （2）、 色谱工作站 （3）、 紫外检测仪 （4）、 恒 流 泵
2、主要器材
（1）、 层 析 柱 （2）、 自动取液器 （3）、 量 筒
（4）、 试 剂 瓶 （5）、 烧 （6）、 滴 杯 管
玻棒、 （7）、 玻棒、等等
四 试剂与配制
4-1、试剂
(1)、 G-25） (1)、葡聚糖凝胶 （Sephades G-25） (2)、 (2)、磷酸氢二钠 (3)、磷酸二氢钠 (3)、 (4)、 (4)、血红蛋白 (5)、 (5)、核黄素
六
实验操作步骤
实验操作步骤
1 、装 2 、平 3 、上 4 、洗 5 、洗 6 、收 7 、测 柱 衡 样 涤 脱 集 定 [柱高：15 cm] 柱高： [2- 倍柱床体积] [2-3倍柱床体积] [上样量：0.5 ml] 上样量： ml， [用量：0.5 ml，2次] 用量： ml/分 [流速：0.5 ml/分] 流速： [免 ] [色谱工作站] 色谱工作站]
0 0 -0.5 5 10 15 20 25 30 时间(min)
二 实验目的与要求
用凝胶柱，分离一含有溶质分子大小不同的样品溶液。 用凝胶柱，分离一含有溶质分子大小不同的样品溶液。 并绘出洗脱曲线。 并绘出洗脱曲线。通过实验了解并熟悉凝胶渗透层析 的原理和实际应用
三
主要仪器与器主材
1、主要仪器
凝胶层析的简单原理图
凝胶层析的简单原理图
A 280 nm 2
蛋白质分离效果图
1.5
1
0.5
0 0 -0.5 2 4 6 8 10 12 时间(min)
A 280 nm
2
蛋白质分离效果图
1.5
A 280 nm
2
蛋白质分离效果图
1.5
1
1
0.5
0.5
0 0 -0.5 5 10 15 20 时间(min)
五 实验装置连接图
实验装置的连接图
实验装置的连接图
1-恒流泵的进口端放入容 器中，出口端与层析柱 器中， 的进口端（上端） 的进口端（上端）相连 接。 2-层析柱的出口（下端） 层析柱的出口（下端） 与紫外检测仪比色管进 口端（下端）相连接。 口端（下端）相连接。 3-紫外检测仪比色管出口 上端） 端（上端）放入回收的 容器中。 容器中。 4-紫外检测仪信号线路输 出端与工作站采集器接 收端相连接。 收端相连接。 5-采集器信号线路输出端 与电脑进口端相连接。 与电脑进口端相连接。
七
面韶仪器的使用
紫外检测仪和色谱工作站介绍 思考题： 思考题： 1、凝胶过滤柱层析为什么也要预先进行 平衡，如果不平衡会产生何种结果？ 平衡，如果不平衡会产生何种结果？
同学开始实验
友情提醒： 友情提醒： 如果我未讲清楚的地方, 如果我未讲清楚的地方,请同学随时反问 授课者,不必客气. 授课者,不必客气.
电脑已调好
务请同学暂时不要使用
谢谢合作
Hale Waihona Puke 凝胶层析
一
原 理
当含有大、小不同分子量的样品溶液加入到凝胶层析柱内后， 当含有大、小不同分子量的样品溶液加入到凝胶层析柱内后，样 品溶液流经层析柱，加之向层析柱内连续不断加入洗脱溶液，小分子 品溶液流经层析柱，加之向层析柱内连续不断加入洗脱溶液， 通过扩散作用进入凝胶颗粒的微孔中， 通过扩散作用进入凝胶颗粒的微孔中，而大分子则被排阻在颗粒之 因此， 小分子向下移动的速度发生差异，必然导致大、 外，因此，大、小分子向下移动的速度发生差异，必然导致大、小分 子分开的距离随之增大。大分子物质行程较短，先流出层析柱， 子分开的距离随之增大。大分子物质行程较短，先流出层析柱，小分 子物质善在行经中，从而将大、小分子分离开来， 子物质善在行经中，从而将大、小分子分离开来，达到了分离的目的。
4-2、试剂配制
洗脱液（ 7.3磷酸缓冲 的配制： 磷酸缓冲） (1)、 洗脱液（0.05 mol / L,pH 7.3磷酸缓冲）的配制： 克于一烧杯中， 分别称取磷酸二氢钠 克；磷酸氢二钠 克于一烧杯中，加蒸馏 水毫升，搅拌溶解即可。 水毫升，搅拌溶解即可。 (2)、样品溶液的配制： (2)、样品溶液的配制： 分别称取血红蛋白、核黄素各20.0毫克于一烧杯中， 分别称取血红蛋白、核黄素各20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲 20.0毫克于一烧杯中 液10.0毫升，搅拌溶解即可。 10.0毫升， 毫升