人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化
人源细胞色素C在大肠杆菌中的重组表达和分离纯化
１５００
Ｏ Ｏ
５
１０
（ｍ１）
围３细胞色素ｃ在ｐＨ ８．Ｏ条件下的层析围
Ｃｈｒ帅ａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｆｔｇ ３
ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ｄ．Ｏ
万方数据
圈４不同ｐＨ条件（５．４，７．５·８．Ｏ）下纯化的细胞色素Ｃ Ｆｉｇ ４ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｐＨ５．４（Ｉａｎｅ １），
万方数据
万方数据
生物医学工程学杂志
第２４卷
或含血红素蛋白的底物‘８３检测。取１０弘ｌ不同浓度的 蛋白加入９６孔板中，再加入１００肛ｌ ＴＭＢ显色液， ３７℃孵育１０ ｍｉｎ，５０ ｐｌ １ Ｍ Ｈ２ＳＯ．终止反应，然后 于４５０ｎｍ测定吸收值。以溶于相同缓冲液中的牛血 清白蛋白为对照。
３结 果
２ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｐ∞ｉａ Ｃｏｍｍｉｔｔ％Ｐｌｌａｒｍａｃｏｐｏｅｉ矗ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ ＲｅｐｕｂＩｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ。２０００．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐｒｅ３ｓ，２０００ｔ４４１．４４３［国家药典委员会编．中华人民共和国药 典．第二部．北京ｔ化学工业出版社．２０００．。４４ｌ－４４３］
由于细胞色素Ｃ的等电点较高，用阳离子交换 分别为５．４，７．５和８．Ｏ时，获得样品的Ａ。。咖／２８咖
纯化是比较好的方法。但是，从图２ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ的 的比值分别为１．９４６，３．３４１和３．６３７。如图４所示，
结果可以看出，经过一次离子交换柱后的细胞色素
用Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ软件（Ｂｉｏ—Ｒａｄ）对电泳图谱进行分
交换的方法分开。虽然从电泳图谱上无法分辨用溶 菌酶破菌后获得的蛋白与另两组有明显差异，但从 获得样品Ａ。。嘶／Ａ。。嘶的比值来看，直接超声破碎和 冻融联合超声破碎组相近，分别为１．５９和１．６７；而 溶菌酶破菌组的比值为１．１２，明显比前两组低。这 表明用溶菌酶处理的样品中含有的杂蛋白多，可能 是因为残留了部分溶菌酶所致。
CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化
CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化【关键词】 CGGBP1；基因表达；纯化0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最多见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳固扩增及其CpG岛异样甲基化致使. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏致使FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方式材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保留. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司；限制性内切酶BamH I 和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术.方式表达载体的构建依照CGGBP1基因起始密码子和终止子临近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物别离加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部份). PCR反映以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR 扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反映缓冲液μL，25 mmol/L MgCl2 μL，DMSO μL，4× dNTP混合物（每种 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板μL（50 ng/μL）， Taq DNA （5 μ/μL）聚合酶μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在Ｔ4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培育基平板并挑取单菌落.融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培育基中， 37℃振荡培育12 h，按10 mL/L比例转接于新鲜培育基，37℃振荡培育至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培育4 h，离心搜集菌体，SDS PAGE分析重组蛋白的表达.蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH ）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后别离将上清和沉淀进行SDS PAGE分析.融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱终止后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 通过2次漂洗后再用 mL洗脱液(250mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步搜集. 取搜集液，进行SDS PAGE 分析.与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L Tris HCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组别离加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组别离再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl， mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，滚水煮10 min，进行SDS PAGE 分析.2结果原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观看到一条约504 bp的条带（图1）；重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A别离用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，别离为 ku和504 bp（图2），均与估量结果相同. 的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，挑选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的 BL21(DE3)菌株，经IPTG 诱导后，在Mr 约25 000处显现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体那么无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部份. 经SDS PAGE分析说明，CGGBP1部份存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）.蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游，插入有持续6个组氨酸的序列—(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag 能够和外源插入片段一起表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方式，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方式. SDS PAGE显示，CGGBP1取得较高程度的纯化（图4）.与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′ d (CGG）293′重复序列双链DNA 结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍以为是DNA复制进程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，致使一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发觉微卫星可能是一种超级活跃的碱基序列，通常各类简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，那个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中超级复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等进程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报导的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式取得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，取得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.【参考文献】［1］Wells RD, Warren ST. Genetic Instabilities and Hereditary Neurological Disorders ［M］. Academic Press, San Diego,1998:46-96.［2］Cleary JD, Nichol K, Wang YH, et al. Evidence of cis acting factors in replication mediated trinucleotide repeat instability in primate cells［J］. Nat Genet, 2002, 31(1)：37-46.［3］Deissler H, Wilm M, Genc B, et al. Rapid protein sequencing by tandem mass spectrometry and cDNA cloning of CGGBP1［J］.Biol Chem, 1997,272(27):.［4］Sinden RR, Potaman VN, Oussatcheva EA, et al. Triplet repeat DNA structures and human genetic disease: Dynamic mutations from dynamic DNA ［J］. Bioscience, 2002,27(1 Suppl 1):53-65.［5］Wahls WP. Meiotic recombination hot spots: Shapping the genome and insight into hypervariable minisatellite DNA change［J］.Curr Top Dev Bio1, 1998,37:37-75.［6］Wahls WP, Moore PD. Recombination hotspot activity of hypervariable minisatellite DNA requires minisatellite DNA binding proteins［J］.Somat Cell Mol Genet, 1998,24(1):41-51.［7］Igarashi S, Tsuji S. The molecular mechanisms of the instability of the CAG repeat［J］. Nippon Rinsho,1998,56(4):1064-1073.［8］Deissler H, Behn Krappa A, Doerfler W. Purification of nuclear proteins from human HeLa cells that bind specifically to the unstable tandem repeat (CGG)n in the human FMR1 gene［J］. Biol Chem, 1996,271(8):4327-4334.。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
HTPP-MDC原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达
ｐ ｎ ｔａｉｇ ｐ ｐｉｅ ＨＴ Ｐ） 家 蝇 抗 菌 肽 天 蚕 素 ｅ ｅｒｔ ｅ ｔ ， Ｐ 与 ｎ ｄ
（ ｓ ｏ ｓ ｃ ｅｒ ｐ ， Ｃ 融 合 ， 建 的 肝 靶 Ｍｕｃ ｄ ｍｅｔ ａ ｃｃｏ ｉ ＭＤ ） ａ ｉ ｎ 构
物 学 活性 研 究及 产业 化 开发 奠 定 了基础 。
关 键 词 ： 靶 向 穿膜 肽 பைடு நூலகம் 肝 家蝇 天蚕 素 ； 融合 基 因 ； 核 表达 原
中图 分 类 号 ： ８ Ｑ７６ 文献 标识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ ２ ４ ５ ２１ ） ５ ０ ６ ３ １ ７ —５ ２ （ ０ ２ ０ —０ １ —０
摘
要 ： 过 双酶 切 、 接 、 化 等 方 法将 肝靶 向 穿膜 肽 一 家蝇 天 蚕 素 （ Ｐ — Ｃ 融 合 基 因克 隆至 原 核 表 达 栽 体 通 连 转 ＨＴ ＰＭＤ ）
ｐ Ｔ ２ （ ） ， 建 重 组 表 达 质 粒 ＨＴ ＰＭＤ ／ Ｅ ３ ａ Ｅ ３ａ ＋ 上 构 Ｐ － Ｃ ｐ Ｔ ２ 。重 组 质 粒 转 化 Ｅ ｃｌ Ｂ ２ （ Ｅ ） ， Ｉ Ｔ 诱 导 ，Ｄ ． ｏｉ Ｌ １ Ｄ ３ 后 以 Ｐ Ｇ ｓ Ｐ ＧＥ分析 表 明 重 组 融合 蛋 白得 到 了可 溶 性表 达 ， ｓｅｎｂ ｔ 交证 实 了表 达 蛋 白 的抗 原 活性 。 为 Ｈ ＰＭＤ 的 生 Ａ Ｗｅｔｒ ｌ 杂 ｏ ＴＰ — Ｃ
２１，ｏ２ Ｎ ． ０２ Ｉ ９ ｏ５亿 与 生 物 互 程 Ｖ ．
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉｅ ｇｎ ｅ ｉｇ ｅ ｓｒ ｏ ｎ ｉｅ ｒ ｎ
ｄ ｉ１ ． ９ ９ ｊｉ ｎ １７ — ５ ２ ． ０ ２ ０ ． ０ ｏ：０ ３ ６ ／．ｓ ． ６ ２ ４ ５ ２ １ ． ５ ０ ５ ｓ
如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体
争鸣如何构建一个真核生物基因在大肠杆菌中高效表达的受体余砚笈由外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理，可以从启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数等方面进行改善构建。
一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
也就是说启动子会有强弱之分。
要获得高效表达必须选择强启动子。
由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能够识别的强启动子控制之下。
通常用的强启动子有lac、trp、tac、bla、λp L等，将外源基因插入这类启动子的下游，可以增加基因的表达产量。
三、终止子有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件，因为它们具有极其重要的作用。
贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵。
这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。
同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录。
四、核糖体结合位点1、Shine-Dalgarno（SD）序列一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。
人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化
人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化吕欣;方海亮;姚敏;尹文;雷迎峰;杨敬;康健【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2008(21)10【摘要】目的:构建人CD81-LEL基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达. 方法:通过PCR扩增得到CD81-LEL基因编码区片段,与pMD18-T载体连接,经序列测定后,再将该扩增片段亚克隆入原核表达载体pET32a(+)中.酶切鉴定正确的表达载体pET32a-CD81-LEL转化表达菌BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白. 结果:成功构建了原核表达载体pET32a-CD81-LEL;SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达且呈可溶性状态,Western-blot显示目的蛋白正确表达,并用镍离子亲和层析法获得纯化的重组蛋白. 结论:CD81-LEL可以在大肠杆菌中表达,为进一步研究CD81与丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E2的结合提供了有用的研究资料.【总页数】4页(P1011-1013,1017)【作者】吕欣;方海亮;姚敏;尹文;雷迎峰;杨敬;康健【作者单位】第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,药学系,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032;第四军医大学,基础部微生物学教研室,陕西西安,710032【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达 [J], 李文秀;周凤云;毛伟平;潘杨滨;何志娟;徐翀;刘宣宣2.人类神经型一氧化氮合酶原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的表达 [J], 付捷;周羽竝;赵迎社;管志文;井柳尧3.人红细胞生成素受体胞外区在大肠杆菌中的表达及纯化 [J], 马姜林;华子春4.人Fcγ RIIb胞外区原核表达载体的构建及表达 [J], 张雷;曹秀琴;杨志伟5.人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 史晓文;刘德敏;孙颖;张捷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备
人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备作者：陈章权*, 黄震, 梁晓东, 陆田田, 何天文【摘要】目的: 原核细胞表达人CD1d分子胞外区及制备其多克隆抗体。
方法: 用RT-PCR法扩增人CD1d分子胞外区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21（DE3）, 用IPTG 诱导重组蛋白的表达, 用亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫小鼠制备多克隆抗体, 并以ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体。
结果: 在原核细胞中高效表达和纯化了人CD1d分子胞外区蛋白, 用其免疫小鼠, 获得了效价高、特异性较好的多克隆抗体, 免疫组织化学检测显示该抗体可识别人小肠组织中的天然CD1d分子。
结论: 成功制备了人CD1d分子胞外区重组蛋白及鼠抗人CD1d分子胞外区抗体, 为进一步建立人CD1d分子的免疫学检测方法及其生物学功能的深入研究奠定了基础。
【关键词】 CD1d 基因表达抗体制备CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子, 分为CD1-I和CD1-II两组, 前者包括CD1a、 CD1b、 CD1c和CD1e等4个分子, 后者只有CD1d分子［1］。
CD1d分子由胞内区、跨膜区和胞外区组成, 胞外区又由α1、α2和α3等3个结构域组成, 它主要提呈糖脂抗原, 在免疫调节及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生发展过程中起重要作用［1, 2］。
在CD1d基因克隆过程中, 我们发现在某些疾病患者体内存在α3结构域或跨膜区缺失的变异体, 跨膜区缺失的变异体的存在提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。
为此, 我们拟建立双抗体夹心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测, 但目前尚未见有其商品化ELISA检测试剂盒。
特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键所在, 在成功制备兔抗人CD1d分子α3结构域抗体［3］的基础上, 我们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达, 并制备了其鼠源性抗体。
人脂联素原核表达载体PQE30ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达
天津医药２００８年１１月第３６卷第１Ｉ期人脂联素原核表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ的构建及在大肠杆菌中的表达幸史晓文刘德敏孙颖张捷８４３摘要目的：构建人脂联素重组表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白。
对表达产物进行鉴定。
方法：将构建好的人脂联素克隆载体ＰＵＣ５７／ＡＤＰＮ与原核表达载体ＰＱＥ３０通过双酶切方法位点特异地连接在一起，再转化人大肠杆菌ＪＭｌ０９感受态细胞中。
通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，并用ＩＰＴＧ在大肠杆菌Ｍ１５中诱导表达。
结果：ＰＣＲ获得长度为７５３ｂｐ目的片段，经ＰＱＥ３０原核表达载体连接、筛选及序列分析后，证实所插入的目的片段与Ｃ，ｅｎＢａｎｋ检索的人脂联素ｅＤＮＡ序列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮＭ一００４７９７）１００％匹配；含重组Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ质粒的大肠杆菌经０．４ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导６ｈ后有表达。
结论：应用并成功构建了人脂联素原核表达载体ＰＱＥ３０／ＡＤＰＮ，且在大肠杆菌中获得有效表达。
关键词胞间信号肽类和蛋白质类基因表达大肠杆菌遗传载体脂联素ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＰＱＥ３０／ＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒａｎｄＩｔｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉＳＨＩＸｉａｏｗｅｎ，ＬＩＵＤｅｔａｉｎ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｅＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｅＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅＰＱＥ３０／ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ（ＡＤＰＮ）ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（Ｅ．）ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：．ｎｌｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮｇｅｎｅＷａＳｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄＰＵＣ５７／ＡＤＰＮ．Ｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｔｏｄｉｇｅｓｔｐｌａｓｍｉｄｓ，ｔｈｅｅｎｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮｇｅｎｅＷ＊ｔ８ｌｉｇａｔｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＰＱＥ３０．Ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｔｗａ￥ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏＥ．ｃｏｌｉＪＭｌ０９ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒｃｈｏｏｓｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒＰＱＥ３０／ＡＤＰＮｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＬＰＴＧ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａ７５３ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔｗａｇｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲｃｌｏｎｅ．Ａｆｔｅｒｂｌｏｔｔｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｍａｔｃｈｅｄｔｏｔｈｅｅＤＮＡｏｆｈｕｍａｎＡＤＰＮ，ｗｈｉｃｈａｃｃｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＧｅｎＢａｎｋＷａＳＮＭＪＩ叫１７９７．ＡｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＷ８８ｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ０．４ｍｍｏｌ／ＬＩＰＩ．ＧｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｉｎＥｃｏｌｉＭ１５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉＰＱＥ３０／ＡＤＰＮｖｅｃｔｏｒｗａｓｆｉｒｓｔｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｌｌｇｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌｇｅｎｅｔｉｃｖｅｃｔｏｒａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ＡＤＰＮ）是脂肪细胞特异性分泌的一种血浆激素蛋白，在循环血液中大量存在，约占人体血浆总蛋白含量的０．０１％ｔ１Ｉ。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
中图分类号 ： Ｑ ８ ７２ 文献标识码 ： Ａ 文章 编号 ： １０ ・１９ ２０ ）０１ １ －３ ０ ８８ ９ （０ ８ １—０ １ ０
Ｃｏ ｉｇ ｎ ｐ ｅ ｉ ｆ ｈ ｕ ｎＣ ８－Ｅ ｅｅｉ Ｅ ｏ ｌ ｎ ｄｅ ｒｓ ｏ ｏ ｅ ｍａ Ｄ １ Ｌｇｎ ｃｌ ｎ ａ ｘ ｓｎ ｔ ｈ Ｌ ｎ ｉ
・
１ ｌ・ ０ｌ
第２ 卷 ｌ
第１ ０期
医 学 研 究 生 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｄ ｃ ｌＰ ｓ ｒ ｄ ａｅ ｏ ｒ ａ ｆＭｅ ｉａ ｏ ｔ ａ ｕ ｔｓ ｇ
・
Ｖｏ ． １ Ｎｏ １ １２ ．０
Ｏｃ ． ０ ８ ｔ２ ０
２０ ０ ８年 １ ０月
论
著 ・
人 Ｃ ８ 细胞外 区大环原核表达载体 的构建及 Ｄ１ 在大肠杆菌 中的表达 和纯化
ｂｏ对 表达产物进行鉴定 ， ｌｔ 用镍离 子亲和层 析法 纯化融 合蛋 白。 结果 ： 成功 构建 了原核表 达载体 ｐ Ｔ ２ —Ｄ １ Ｅ ３ ａＣ ８ 一
Ｌ Ｌ Ｓ ＳＰ Ｇ Ｅ ：Ｄ ．Ａ Ｅ显示 目的蛋 白大量表达且呈可溶性状 态 ， ｓ ｒ—ｌ 显示 目的蛋 白正确表 达 ， 用镍 离子亲 和层 Ｗｅｔ ｎｂ ｔ ｅ ｏ 并
Ｌ ｎ ，Ｆ Ｇ Ｈａ． ａ ｇ ，ＹＡＯ Ｍｉ ０ Ｘｉ ＡＮ ｉ ｉｎ １ ｎ ，ＹＩ ｎ Ｎ Ｗｅ ，Ｌ ＩＹｉｇｆｎ Ｅ ｎ ． ｇ ，ＹＡＮＧ Ｊｎ ＡＮＧ ｉｎ ｅ ｉｇ ，Ｋ Ｊａ
（ ．Ｄｐ ｒ ｎ ｏ ｃ ｂ ｌ ｙ ２ ｅａｔ ｎ ｏ ｈ ｒ ａｙ ｈ ｏｒ ｌａｙＭｅ ｉ ｌＵ ｉ ｒ ｔ， １ ｅａｔ ｔ ｆＭｉｏ ｉ ｏ ； ．Ｄｐ ｒ ｔ ｆＰ ａｍ ｃ ，ｔ Ｆ ｕ ｈ Ｍｉｔｒ ｄｃ ｎ ｅ ｉ ｍｅ ｒ ｏｇ ｍｅ ｅ ｔ ｉ ａ ｖ ｓｙ Ｘ ’ ｎ７ ０ ３ ， ｈ ａ ｘ ， ｈｎ ） ｉａ １ ０ ２ Ｓ ａ ｎ ｉ Ｃ ｉａ
口
口
欣 方海亮 姚 ， ，
敏 尹 文 雷迎峰 杨 敬 康 ， ， ， ，
健
（ 第四军医大学 ，． １基础部微生物学教研室 ； ． ２ 药学系， 陕西西安 ７０ ３ ） １０２
摘 要 ： 目的 ： 构建人 Ｃ ８ ． ，基 因的原 核表 达 载体 ， 在 大肠 杆 菌 中进行 表 达 。 方法 ： Ｄ１ Ｊ 并 通过 Ｐ Ｒ扩 增得 到 Ｃ
Ｃ ８ ． 基因编码区片段 ， ｐ Ｄ ８Ｔ载体连接 ， Ｄ １ 与 Ｍ １一 经序列测定后 ， 再将该扩增片段亚克隆入原核表达载体 ｐＴ ２ （＋） Ｅ ３ａ
中。酶切鉴定正确 的表达 载体 ｐ Ｔ ２ ． Ｄ １Ｌ Ｌ转化表达菌 Ｂ ２ （ Ｅ ） Ｅ ３ ａＣ ８ 一Ｅ Ｌ １ Ｄ ３ 进行诱 导表达 ， Ｓ ＳＰ Ｇ 用 Ｄ 的重组 蛋 白。 结 论 ： Ｄ １Ｌ Ｌ可 以在 大肠 杆 菌 中表达 ， Ｃ ８ 一Ｅ 为进 一 步 研究 Ｃ ８ Ｄ １与 丙 型肝 炎 病 毒 （ Ｖ） ＨＣ 包膜糖蛋 白 Ｅ ２的结合提供 了有用 的研究资料 。 关键词 ： Ｃ ８ ； 载体构建 ； 基 因表达 ； 包膜糖蛋 白 Ｄ１
Ｐ ＡＧＥ ａ ｄ Ｗ ｅ ｔｒ ｌｔ ｈ ｒ ｔ ｉ Ｄ８ ． Ｅ ｕ ｅ ｔ ｓ ｔ ｇ ｗａ ｕ ｆ ｄ ｂ ． Ａ ｒ ｓｎ ｃ １ ｎ ｓｅ ｎ ｂ ｏ ．Ｔ ｅ ｐ ｏｅ ｎ Ｃ Ｌ Ｌ ｆ ｓ ｄ ｗｉ Ｈｉ ａ ｓ ｐ ｒ ｅ ｙ Ｎｉ １ ｈ ｉ ｉ ＮＴ ｅ ｉ ｏ． ｎ ． Ｒｅ ｕ ｔ ：Ｔ ｅ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｌｓ ｄ ｐ Ｔ ２ ． ８ ． ＥＬ ｗ ｓ ｓ ｃ ｅ ｓ ｌ ｏ ｓ ｕ ｔ ｄ ａ ｄ Ｃ 一 ａｎ ｓｌ ｓ ｈ ｅ ｏ ｉ ａ ｔｐ ａ ｍｉ Ｅ ３ ａ ＣＤ Ｌ ａ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｃ ｎ ｔ ｃｅ ｎ Ｄ８ １ ｕ ｙ ｒ １ Ｌ Ｌ ｅｆ ｉ ｎｌ ｘ ｒ ｓ ｅ ｎ Ｅ ｃ ｉ Ｅ ｆ ｃｅ ｔ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｉ ． ｏｌ ｉ ｙ ． Ｃｏ ｃ ｕ ｉ ｎ：Ｔ ｅ ｃ ｏ ｉ ｇ ａ ｄ ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓ ｎ ｏ ｈ Ｄ８ ． 观 ｎ ｌ ｓｏ ｈ ｌｎ ｎ ｎ ｈ ｘ ｒ ｓｉ ｆ ｔ ｅ Ｃ Ｌ ｏ １
ｐａｍｉ Ｅ ３ ａ ｌｓ ｄ ｐ Ｔ ２ （＋ ） ｈ ｅ ｏ ｉａ ｔｐａｍｉ Ｅ ３ ａ Ｃ Ｉ ｓｔｅ ｒｎ ｆｒ ｄ ｉｔ ． ｃｉ ．Ｔ ｅ ｒｃ ｍｂｎ ｎ ｌｓ ｄ ｐ Ｔ ２ ． Ｄ８ ． Ｌ ｗａ ｈ ｎ ｔ ｓｏｍｅ ｎｏ Ｅ ｏｌ １ ａ Ｂ ２１ Ｄ Ｌ （ Ｅ３）ｔ ｘ ｒｓ Ｄ８ ． ＥＬ ｉｄ ｃ ｄ ｗ ｔ Ｇ．Ｔ ｅ ｅ ｐ ｅｓｏ ｒｄ ｃ ｓｄ ｔｃｅ ｙ Ｓ ． ｏ ｅ ｐ ｅｓ Ｃ １ Ｌ ｎ ｕ ｅ ｉ Ｉ ｈ ｈ ｘ ｒｓｉｎ ｐ ｏ ｕ ｔｗａ ｅｅ ｔｄ ｂ ＤＳ
Ａ ｓ ａｔ Ｏ ｊ ｃ ｖ ： ｏｃｎｔ ｃ ａｒｃｍ ｉ ｎ ｒｋｒｏｉ ｐａｍｉ ｏ ｅＣ ８ ．肛 ｇｎ ｎ ｂ ｂ ｔ ｃ ： ｂｅｔ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｕ ｔ ｅｏ ｂｎ ｔ ｏ ａｙｔ ｌ ｄ ｆ ｈ Ｄ Ｌ ｒ ｉ ｒ ａ ｐ ｃ ｓ ｔ １ ｅ ｅａｄ ｏ ．