实验八 DNA的限制性内切酶酶切和鉴定
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定
限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一．原理质粒是双链环状DNA，有多个限制性内切核酸酶切位点。
在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。
二．材料（1）重组质粒；（2）所需的限制性内切核酸酶和其反应缓冲液；（3）琼脂糖凝胶电泳所需试剂和设备。
三．方案1．单酶切反应（1）按下表加入试剂。
反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7（2）将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（3）琼脂糖凝胶电泳观察结果。
2.双酶切反应若两个酶反应条件相同时，参照上述方法进行，反应条件不同时，需分别进行酶解反应。
（1）第一步酶解反应：质粒DNA 1-2 ug（1ug/ul） 2 ul缓冲液 2 ul内切酶 1 ul双蒸水15 ul总体积20 ul离心混匀，37℃,1h。
（2）乙醇沉淀法沉淀线性化的DNA，再重建下一步的反应体系。
（3）第二步酶解反应：沉淀的DNA17中加双蒸水17ul。
双蒸水（含上一步沉淀的DNA）17 ul缓冲液 2 ul内切酶 1 ul总体积20 ul离心混匀，37℃，1h。
电泳鉴定。
四．注意事项（1）限制性内切核酸酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于冰箱外；酶最后加入到反应体系中。
（2）限制性内切核酸酶溶液通常含有50%的甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分摇匀（可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。
切忌振荡混匀！）。
（3）注意酶的用量，酶量并不是越多越好。
一般可参照说明书来确定。
酶量过大（酶：DNA ≥25U／μg）时，有产生所谓星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割；为避免星号活性，甘油浓度应< 5 %。
此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少NaCl和存在Mn2+等情况下，都有可能出现星号活性。
（4）互补性的黏末端在用DNA连接酶连接后，不能再用限制酶切割。
酶切验证的原理
酶切验证的原理酶切验证是一种常用的分子生物学技术，主要用于确认DNA序列是否正确。
其原理基于酶切作用和凝胶电泳技术，通过对DNA进行限制性内切酶切割并在凝胶中进行电泳分离，最终可以得到所需的DNA片段。
以下将详细介绍酶切验证的原理。
一、限制性内切酶的作用原理限制性内切酶是一类特殊的酶，它能够识别并切割特定的DNA序列，从而产生具有特定长度的DNA片段。
这些限制性内切酶通常由细菌产生，并且被广泛应用于分子生物学领域。
限制性内切酶的作用基于其与DNA序列之间的互作。
具体来说，当一个限制性内切酶遇到其所识别的特定DNA序列时，它会在该序列上结合并发生水解反应，将该DNA序列剪断成两个互补的单链DNA片段。
这种水解反应通常发生在两个特定碱基之间，并且遵循着不同种类限制性内切酶所具有不同的识别和剪断规律。
二、凝胶电泳的作用原理凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA片段的技术，其基本原理是将DNA片段在电场作用下沿着凝胶中的孔隙移动，从而实现对DNA片段的分离和检测。
凝胶电泳通常使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质。
这种凝胶具有一定的孔隙大小和形状，可以让不同大小的DNA片段通过，并且能够阻止大分子物质通过。
在进行凝胶电泳实验时，将待检测的DNA样品加入到含有缓冲液和染料的孔隙中，在加上电场后，DNA片段会沿着电场方向移动，并逐渐被分离出来。
最终，通过染色或其他方法可以显示出不同长度的DNA片段，并进行定量或比较分析。
三、酶切验证实验步骤1. DNA提取：从细菌、植物或动物组织中提取所需的DNA样品。
2. 限制性内切酶切割：选择合适的限制性内切酶并按照其所需条件进行反应，在反应结束后通过电泳检测是否得到所需的DNA片段。
3. 凝胶电泳：将切割后的DNA样品加入到凝胶中，并在加上适当的电场后进行分离和检测。
4. 染色和可视化：使用染料或其他方法将分离出来的DNA片段染色，并通过紫外线照射或其他方法进行可视化。
5. 分析和确认：根据实验结果进行分析和确认，确定所需的DNA序列是否正确。
实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制性内 切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶 组成。II型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因 子，能识别双链DNA的特定序列，一般为4-6个碱 基的反转重复序列。II型限制酶一般在识别序列内 进行切割，产生特异的DNA片断。
切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
• 本周实验报告： 1. 实验原理 2. 实验步骤 3. 实验结果 4. 实验结果分析 • 下周请预习：离心吸附柱法从琼脂糖凝胶
中回收DNA
0.5μl
④ Xho I (10Units/μl)
0.5μl
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴，反应1小 时。
三、实验步骤
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓
冲液，混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样
27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中
二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在某 些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的现 象。其结果是酶切条带增多。
– 星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
DNA的限制性内切酶酶切
DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。
2.了解限制性内切酶的特点。
实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。
根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。
绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。
实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。
（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。
（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。
实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。
（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。
（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。
注意事项（1）注意要在冰上操作。
（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。
实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。
思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。
分子生物学实验思考题答案
分子生物学实验思考题答案实验一、基因组DNA的提取1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA?答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。
而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。
所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段.2、如何检测和保证DNA的质量？答、用凝胶电泳看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断，当OD260/OD280< 1.8，表示蛋白质含量较高当OD260/OD280> 2.0，表示RNA含量较高当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯。
实验二、植物总RNA的提取1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。
答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。
C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；E）所使用的器皿必须干净。
DNA 的限制性内切酶酶切分析
在处显绿色荧光条带 ，观察酶切后与未酶
切质粒的DNA带位置。
100bp DNA 未酶切
Marker
质粒
已酶切 质粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁， 用掌型离心机离心到底部!
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水 汽进入管内，使反应体积大大增加，造成酶切 失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘 油) ，每次吸取后应放在冰盒，用完后立即放在 -20℃，新购的大包装酶应先分装
4.倒胶时不能有气泡，若有需立刻用枪尖吸掉 或牙签挑破
5.点样孔置负极一端，点样时也应检查点样孔 中有无气泡，电泳前正确连接正负极
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入 电泳槽 (先胶布封口，放好梳子)。
4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer +5ul酶切产物
或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示剂) 移动至胶前沿2cm处停止电泳(约30min)。 （不超过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？ 如果会，请说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳 图谱，综合前两个实验，分析可能的原 因
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书
限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒作业指导书实验目的掌握单、双酶切的技术，理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。
实验原理(一)酶切各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序，例如，Eco R Ⅰ酶的识别顺序为：GAATTC；Scal I酶的识别顺序为：AGTACT，用Eco R I和Scal I同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链DNA分子，就产生两条带有相应酶切位点的线性DNA分子。
当Eco R I和Scal I同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。
不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度，但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。
因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专门的缓冲液。
如果盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变，例如当盐离子浓度低于50mmol／L时，Eco R I内切酶的专一性就降低，只能识别中间的4个核苷酸序列(称该酶为Eco R I*)。
绝大多数酶的反应温度是在370C，酶切反应时间需30min、60min以至2h以上。
一般来说，如酶的纯度不佳，酶切时间不能太长。
终止酶切反应时，大多数可在65℃水浴中，保温10min，就可使大部分酶失活。
Eco R I酶置65℃水浴中，保温10min，丧失95％的酶活性。
内切酶一般都保存在50％甘油的缓冲液中。
当保存在10％甘油中时，酶活力丧失更快。
少数较耐热的酶，在加热前先加pH7.5的EDTA，至终浓度为10mmol／L。
EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子，就更便于终止酶切反应。
酶切要完全，酶解的数量也要适当。
设计酶解DNA的数量时，除了根据连接与转化的要求外，还要按照DNA浓度的高低，酶液单位的高低等具体情况而定。
同时还要考虑到DNA每经一步处理，就得重新纯化，这样DNA浓度的损失量几乎达到50％。
并且每经一步操作后，都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。
因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。
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5´GAATTC EcoRⅠ CTTAT TTCGAA5´
质粒pUC18的物理图谱
三、材料
重组质粒； EcoRI 酶及其酶切缓冲液 : 购 买成品； HindⅢ酶及其酶切缓冲液 : 购 买成品;琼脂糖(Agarose) 。 四、仪器 移液器及吸头，水平式电泳装置,电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液 枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪。
五、试剂
1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液
六、操作步骤 1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号, 用微量移液枪分别加入质粒 DNA （5---14 μl ）和 相应的限制性内切酶反应 10×缓冲液 2μl, 再加入重蒸水 使 总 体 积 为 18μl, 将 管 内 溶 液 混 匀 后 加 入 EcoRI 和 HindⅢ 各 1μl, 用手指轻弹管壁使溶液混匀 , 也可用微量 离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验 成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应 尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、 混匀反应体系后 ,将eppendorf管置于适当的支 持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时, 使酶切反应完全。 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停 止反应,置于冰箱中保存备用。
实验八
DNA的限制性内切酶 酶切和鉴定
一、实验目的
1. 掌握限制性内切酶的特性。 2. 了解限制性内切酶的用途。
二 、 DNA 限 制 性 内 切 酶 概 述 和 分 析
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶 识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上 ,并切 割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白 质分子中兼有切割和修饰 ( 甲基化 ) 作用且依赖于 ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位 点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA分 子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成 : 一种为限 制性内切核酸酶 (限制酶 ),它切割某一特异的核苷酸序 列; 另一种为独立的甲基化酶 , 它修饰同一识别序列。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用， 它们是重组DNA的基础。 绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4至 8个核苷酸的 回文对称特异核苷酸序列。
七、电泳检测 在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色，紫外 透射 仪下观察或拍照。
思考题： 1. 写出EcoRI和 HindⅢ两种内切酶消化产物的末 端序列。 2. 什么是粘性末端和平末端？ 3. 限制性内切酶在基因工程中有什么作用？