细胞培养工作流程

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一、 Vero细胞复苏流程 1、 准备 1.1工作地点检查： 检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。 1.2设施检查： 确认空调、传递窗工作状态完好。 1.3层流罩准备： 开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。 1.4操作工具和试剂检查： 检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。 1.5复苏用水准备： （1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。 （2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。 1.6操作人员进入层流罩： 穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。 1.7溶液使用前处理： 辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。 2、 配液 配方 复苏液 MEM生长液 名称 加入量（ml） 含量控制范围 加入量（ml） 含量控制范围 MEM培养基溶液 100 / 300 / 新生牛血清 10 9%～10% 15 4.5%～5.5% 3%谷氨酰胺溶液 1 0.9%～1% 3 0.9%～1% 庆大霉素 0.1 0.12%～0.13% 0.4 0.12%～0.13%

7.5%NaHCO3 1.5 1.5%～1.8% 4.5 1.5%～2%

辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。 精品文档 . 辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。 3、 种子支领 依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。 4、 种子速溶 种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。 5、 移种 操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。 6、 培养 辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。 7、 清场 将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间， 层流罩内用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。 8、 复苏后观察 第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。 9、换液 换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。 辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2）。拧紧瓶口，平放到恒温室培养。最后按规定清场 精品文档 . 二、 细胞传代流程 1、 准备 1.1工作地点检查： 检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。 1.2设施检查： 确认空调、蠕动泵工作状态完好。 1.3层流罩准备： 开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。 1.4操作工具和试剂检查： 检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。 细胞传代用液体：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3

溶液、0.01MPBS溶液、细胞消化液（含0.25%的胰蛋白酶溶液）。 2、 传代1操作 2.1配液 配方 MEM生长液 名称 加入量（ml） 含量控制范围 MEM培养基溶液 400 / 新生牛血清 20 4.5%～5.5% 3%谷氨酰胺溶液 4 0.9%～1% 庆大霉素 0.5 0.12%～0.13% 7.5%NaHCO3 8 1.8%～2%

向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。 注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。 2.2洗涤 辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：30ml/ T75 cm2瓶。（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。 精品文档 . 注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。 2.3消化 辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。 注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。 2.4悬液制备 辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养瓶打开，用吸管吸10ml至T75 cm2瓶中，用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。 注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。 2.5分种 操作人员将细胞悬液平均分种至2个T175 cm2培养瓶中，，加生长液至75ml。 2.6培养 辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。 2.7清场 按规定清场 2.8观察 每天观察细胞生长状态 3、传代2操作 3.1配液 配方 MEM生长液 名称 加入量（ml） 含量控制范围 MEM培养基溶液 600 / 新生牛血清 30 4.5%～5.5% 3%谷氨酰胺溶液 6 0.9%～1% 庆大霉素 0.75 0.12%～0.13% 7.5%NaHCO3 12 1.8%～2%

向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。辅助人员精品文档 . 盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。 注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。 3.2洗涤 辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。 注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。 3.3消化 辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。 注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。 3.4悬液制备 辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养瓶打开，将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。 注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。 3.5分种 操作人员将细胞悬液平均分种至8个T175 cm2培养瓶中，加生长液至75ml。 3.6培养 辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。 3.7清场 按规定清场 3.8观察 每天观察细胞生长状态 4、 传代3操作 4.1配液 配方 MEM生长液 名称 加入量（ml） 含量控制范围