酶联免疫吸附实验
ELISA试验方法
ELISA试验方法ELISA试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），也称酶联免疫吸附试验，是一种常用于检测抗原或抗体的敏感且特异性的实验方法。
ELISA试验既可以用于研究基础科学，也可以应用于诊断医学、生物制药、科研开发等领域。
第一步：固相吸附首先，将特异性抗原或抗体加入固相载体，如微孔板或磁珠，通过吸附作用将其固定在载体上，形成固相。
然后，将未被吸附的地方进行阻断，例如使用牛血清蛋白（BSA）或胸腺素等阻断剂来封闭非特异性结合位点，减少非特异性结合。
第二步：样品加入将待检样品加入固相，并充分与特异性抗原或抗体反应。
如果待检物是抗原，则待检样品中存在的特异性抗体会与固相上的抗原结合。
如果待检物是抗体，则待检样品中存在的抗原会与固相上的抗体结合。
第三步：洗涤通过反复洗涤固相，去除非特异性结合的物质，确保只有特异性结合物留在固相上。
典型的洗涤液包括缓冲盐水或洗涤缓冲液。
第四步：二抗加入将经过酶标记的二抗加入固相，使其与特异性结合的抗原或抗体结合。
酶标记的二抗可以与特异性结合物形成二抗-抗原或二抗-抗体复合物。
第五步：洗涤再次进行洗涤步骤，去除非特异性结合的酶标记的二抗，确保只有特异性结合的复合物留在固相上。
第六步：底物加入将含有底物的反应物加入固相，使其与酶标记的二抗发生反应。
底物与酶标记的二抗之间的反应产生颜色变化，即可定性或定量检测待检物质的存在和浓度。
第七步：反应停止通过加入反应停止剂，停止酶反应，阻止进一步的底物转化为产物。
产物的生成量与待检物质的浓度成正比。
最后，通过光度计或酶标仪等检测设备，测量产生的颜色变化的光密度，可以定性或定量计算待检物质的存在和浓度。
ELISA试验具有高度的敏感性和特异性，能够检测低浓度的抗原或抗体。
它的操作简单、重复性好，广泛应用于生物医学研究、临床检测、植物检测、食品检测等领域。
不过需要注意的是，ELISA试验的结果受到很多因素的影响，如抗体的质量和纯度、试剂的质量和保存条件等，因此在进行ELISA试验时需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可重复性。
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附试验
基 本 原 理
先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上， 并保持其免疫活性。
测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步 骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法洗去多余的分离抗原-抗体复合物和 游离成分。 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定 量测定。
反 应 模 式
酶联免疫吸附试验的主要技术类 型有双抗体夹心法、间接法、竞 争法、捕获法、生物素-亲和素等。
1，双抗体夹心法： 此法常用于检测抗原
它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分 子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而 不能用于小分子半抗原的检测。
2，间接法测定抗体 此法常用于测定抗体
将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与 抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待 测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量 与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成 功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、 寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已 应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定， 根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、 特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等 特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于 一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此， 也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用 来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环 抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
5，生物素-亲和素
ABS为亲和素、生物素系统的略语。亲和素与 生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强， 亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个 亲和素分子有4个生物素分子的结合位臵，可 以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似 晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS 偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
酶联免疫吸附试验
实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）一、实验目的了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。
二、实验原理将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。
常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）RZ>3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
常用的三种类型：1、间接法测抗体（间接ELISA）间接法用于测定抗体。
它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）双抗体夹心法用于检测抗原。
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。
操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。
底物的降解量＝抗原量。
3、竞争ELISA竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。
它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（ELISA）——直接法一、原理酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。
其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。
在本实验中，以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，与相应抗原IgG结合，标记的酶可催化底物（邻苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
二、材料：1. 人IgG包被的微量酶标反应板（1：1万，1：10万，1：40万，1：80万，1：100万），2. 酶标抗人IgG抗体稀释液、洗涤液（PH7.4，0.01M PBS-Tween20）、底物溶液，3. 微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37℃恒温箱等。
三、方法：1. 人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入第1至5孔，设第6孔为对照。
置37℃恒温箱2小时，取出，移入4℃冰箱过夜。
取出，用洗涤液洗3次，3分钟/次（略）。
2. 用含小牛血清（BSA）的PH7.4 PBS封闭，置37℃恒温箱，30分钟，取出。
用洗涤液洗3次，3分钟/次（略）。
3.用微量移液器吸取100ul酶标抗人IgG抗体，分别加入第6至1孔。
置湿盒中，于37℃恒温箱中孵育30分钟。
4. 取出酶标板，用洗涤液洗3次，3分钟/次。
5. 按第6孔至第1孔的顺序，每孔各加100ul的底物溶液，置37℃恒温箱中10-15分钟。
6. 观察显色反应。
四、结果五、结论。
酶联免疫吸附试验
全自动设备：
酶和底物：主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，还有 β-半乳糖苷酶、尿酶等。
1. 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP) 应用最广泛。是从辣根菜中提取的酶类，由糖 蛋白和辅基（含铁血红素）构成，辅基为酶活性中心所在，在 403nm 波长处有最大吸收峰，糖 蛋白在 275nm 波长有最大吸收峰，故用 A403nm 与 A275nm 比值代表纯度（reinheir zahl,RZ）。 用于酶免疫技术的 HRP，其 RZ 值应大于 3.0。但注意酶纯度不代表酶活力，酶变性后，RZ 不变 但活力下降。
基本原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物， 再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人 IgG 抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成 固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。 【操作步骤】
竞争法 ELISA 可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测。 方法和特点: ①酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体 （抗原）结合的能力 ②反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位 点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子量和 ③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性） 与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比
免疫吸附剂的制备
免疫吸附剂的制备（点击播放）
免疫吸附剂的制备：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂，将抗原或抗体固相化的过程称为包被 (coating)，若以聚苯乙烯为载体，包被方法是：将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为 pH9.6 的 碳酸盐缓冲液）中， 加入 ELISA 板孔中在 4℃过夜后甩弃孔内液体，用洗涤液清洗即可。如果 包被液中蛋白浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物 中的蛋白也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况 下，如在包被后再用 1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭 (blocking)。
酶联免疫吸附试验
这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化 合物中测定某一特定物质，而不需要先分离待测物。
2，敏感性
在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法 的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感 度约为5~10 μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和 浊度法的敏感度与酶反应相仿。 而酶标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍， 达ng/ml水平。
聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作 工艺的差别，各种产品的质量差异很大， 因此，每一批号的ELISA板在使用前须事 先检查其性能。
常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为 10ng/ml） 包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人 IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测 每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8 左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均 数之差，应小于10%。
这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量， 而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然 后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
生物素-亲和素酶联吸附试验（BA-ELISA）： 待检抗原与固相抗体反应后，再加入生物素化 第二抗体，形成抗原-抗体-生物素化第二抗体复 合物，然后与酶标亲和素作用，并通过底物而 显色。
解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲 和层析法来提纯抗体或抗原（亲和层析纯抗体）。
最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体 复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最 合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗 体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。
特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇 与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构 和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有 高度的特异性。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
酶联免疫吸附实验(ELISA)1.实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
2.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
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免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
酶
抗原抗体反应
特异性
示踪物标记
灵敏性
荧光素
同位素
免疫标记技术的主要特点： 高度特异性、高度灵敏性
免疫标记技术
放射物标记技术
酶标记技术
免疫荧光技术
其他标记技术
酶联免疫吸附技术
酶免疫组化技术
酶免疫技术(enzyme immunoassay)
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反 应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原 或抗体的一种免疫学标记技术。
1、所有样品按传染源处理； 2、加试剂前应混匀，力求滴加准确； 3、加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成； 4、洗涤时各孔均需加满，洗涤必须彻底，防止产生假阳性； 5.温育的时间要严格控制。
自习
五、 ELISA的影响因素
（一）固相载体 （二）抗原 （三）试验样品 （四）结合物 (五）洗涤剂与稀释剂 （六）底物 （七）作用时间 （八）结果判断 (九)试验的重复性（精确度） （十）对使用仪器要求
ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是 蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保 持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物， 而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底 物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜 色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比 例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附实验
一、实验目的
• 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理
• 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法
• 了解其他免疫标记技术
二、实验原理
免疫学分析方法发展很快，特别是在使用 标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来 许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都 不能相比。继50年代的免疫荧光（IF）和60年 代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代 初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技 术（酶免疫技术）。
（十）对使用仪器要求
所用仪器如吸管、烧杯试管都要清洁，用于酶 结合和底物的吸管和容器一定要分开。试剂要 求标准化
六、ELISA的应用
ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上 ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直 接定量测定体液中的可溶性抗原。酶免疫试验（EIA） 结合光学显微镜或电子显微镜可进行抗原定位与结 构的研究，用酶标记抗原或抗体结合免疫扩散及免 疫电泳可提高试验的敏感性。在实际应用方面可作 疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、 兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它 和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病 学及传染病学等方面密切相关 。
(一):检查抗原和半抗原方面
1.内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜 促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促 甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当 2.在血液学方面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ 凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白 （Hapto Globin）等 3.在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌 胚抗原（CEA），对前者的敏感性已达到与 放射免疫试验相当的水平，但对CEA检查的 敏感性较低，目前尚不能用于常规诊断
(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法， 也 是目前最常用的方法.
三、实验步骤
乙肝病毒存在三对抗原抗体系统 1.即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗-HBs）、 2.e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）、 3.核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc）
因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难， 故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。 HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb HBeAg, HBeAb HBcAb(IgG,IgM) 乙肝表面抗原，存在于HBV感 染者的血清中,为感染指标之 一。
（八）结果判断
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反 应的深浅作出判断，也可用分光光度计作 精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观 察更为简便，而且也有一定正确性。 不论用哪种方法判定结果，每次都 要有阳性和阴性参考血清作对照，这样可 以消除一些外界的影响因素。
(九)试验的重复性（精确度）
记录结果有下列几种方法： 1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4） 的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴 性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以 一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到 的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度 能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该 标本的滴度。
（二）抗原
包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和 稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原 中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性 和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫 学活性。 对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗 原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性 抗原均可用于ELISA。 对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚 培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多 非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲 和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。
（三）试验样品
血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标 本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固 收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM 和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳 定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清最好要新鲜， 若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复 冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片 法采血。
（四）结合物
在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合 物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用 ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物， 而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的 酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。
（五）洗涤剂与稀释剂
加入牛血清白蛋白（BSA）和吐温—20抑制非 特异性蛋白的竞争性吸附作用。 它们有良好的封阻作用
实验材料
1.HBsAg诊断试剂盒 2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待 检血清
微孔条已经包被HBsAb
1、编号：微孔条按顺序编号。 2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。 3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加， 轻拍混匀。 4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。 5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持 30-60秒的浸泡时间）。 6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗 置10-15分钟。 7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。 8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果， 读数在加终止液10分钟内完成。
（六）底物
（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的， 而经 酶催化后有明显的颜色变化，这样可 使结果分辨清楚； （2）所显色泽易干洗脱； （3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定 时所产生的有色物质应该是可溶性的； （4）价廉，易得而且无毒。
（七）作用时间
(1) 任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测 定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进 行校正，校正可按下列公式： 校正后O.D绝对值=被检标本的O.D值*（1.0/阳性标本的 O.D值） (2) 制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时， 当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间， 如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同 一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。
Ag + AbE
AgAbE + 底物 呈色反应
酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）
是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固 相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种 病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面 的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量 测定。 ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操 作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之 内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行 病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环 抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
4 、以“比值”表示：求出被检标本的 O.D 值与一组阴性标 本O.D值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性， 比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。 测定标本O.D值-空白O.D值 —————————————≥2.1 阴性对照O.D值-空白O.D值 如在此测定时以空白校正“O”点。 5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一 个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检 测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。 以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数， 再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。