全面酶联免疫吸附实验.ppt
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酶联免疫吸附试验的基本原理 ppt课件
（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原 与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结 合的物质。
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（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗 涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质 的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反 应的程度进行该抗原的定性或定量。
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（二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定 簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本 的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了 操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感 性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELISA提高 到新水平。
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18
（2） HBeAb的竞争法：先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体， 同时加入待测标本和中和抗原HBeAg，此时待测标本中的HBeAb和固 相抗体竞争结合中和抗原HBeAg，待测标本中HBeAb浓度越高，则与 固相抗体结合的HBeAg就越少，反之亦然；温育后洗涤，加入酶标记 的特异性抗体，酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合， 温育后洗涤，加入底物显色，显色的强弱与待测标本中的HBeAb含量 呈反比。
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（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。 洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM抗体 存在，是为阳性反应
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酶联免疫吸附试验ELISA.ppt
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
4. 原理（以间接ELISA为例）：
显色
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
间接法测定猪瘟抗体 ——定性检测
实验材料
猪瘟病毒（CSFV） —— 抗原 样品 —— 待测猪血清 HRP标记猪抗兔IgG —— 二抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB ，底物缓冲液，30% H2O2 酶标板，酶标仪
• 分类：
酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)
1.定义
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。
2.原理
（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连
（3）双抗体夹心法测定抗原
A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体;
E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。
（4）竞争法测定抗原
A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次在干净吸水纸上 拍干。
3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30分钟。 4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。 5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。室温避光显色，10分钟
酶免疫技术—酶联免疫吸附试验(免疫学检验课件)
（二）最适工作浓度的选择
在ELISA测定中应对包被抗原或抗体的浓度和酶标 抗原或抗体的浓度予以选择以达到最佳的测定条件以 间接法测抗体为例
1．酶标抗抗体工作浓度的选择
（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已 包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A）值 在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。
抗原
E
E
E 底物
捕获法
EE E
E
（+）
EE
（-）
3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的 是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF （IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与 随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导 致假阳性反应。
非特异IgM由于其在第一步温育中， 可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以 会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测 IgM，必须对临床样本进行适当稀释。
E
2．技术要点
（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的
定性或定量。
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
3．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF) 的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假 阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶 标抗体可消除RF的干扰。
E E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（2）竞争法检测HBeAb：
酶联免疫吸附测定法ppt课件
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
酶联免疫吸附测 定法
免疫学实验
基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
实验原理 双抗体夹心法
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
几种酶标分析仪
NM-9602 标配酶标分析仪
1酶联免疫吸附试验ELISA课件
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
… …
摇匀，37℃，水浴15min
（1份/2人）
预期果：
1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。
溶血
不溶血
2.
试验管
血清对照管
抗原对照管
补体对照管
SRBC对照管
？
溶血
溶血
溶血
不溶血
1.酶联免疫吸附试验（ELISA)
免疫标记技术
定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP
免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA)
材料：
方法：
1
2
3
4
5
试验管
血清 对照管
抗原 对照管
补体 对照管
SRBC 对照管
待测血清
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.4mL
0.8mL
抗原
补体
N.S
摇匀，37℃，水浴15min
溶血素
SRBC
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
… …
… …
… …
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… …
… …
… …
… …
摇匀，37℃，水浴15min
（1份/2人）
预期果：
1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。
溶血
不溶血
2.
试验管
血清对照管
抗原对照管
补体对照管
SRBC对照管
？
溶血
溶血
溶血
不溶血
1.酶联免疫吸附试验（ELISA)
免疫标记技术
定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP
免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAssay,EIA)
材料：
方法：
1
2
3
4
5
试验管
血清 对照管
抗原 对照管
补体 对照管
SRBC 对照管
待测血清
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.4mL
0.8mL
抗原
补体
N.S
摇匀，37℃，水浴15min
溶血素
SRBC
0.2mL
0.2mL
0.2mL
0.2mL
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
酶联免疫吸附实验ppt课件
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
19
20
第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
23
工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
16
第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
酶联免疫吸附试验 PPT课件
7、 酶标二抗：稀释HRP标记羊抗猪IgG，每孔100µL， 37℃作用30min； 8、洗涤； 9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温 避光作用15min； 10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸； 11、读数：用酶标仪检测OD450值。
ELISA的优点：
血清学方法有很多种, 如传统的琼脂扩散( A G ID ) 、 血 凝抑制( H A / H I ) 、 乳胶凝集、 试管凝集、补体结合 等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技 术与其有着不同的特点： 1、灵敏度高。ELI SA是通过酶促反应放大检测信号, 从 而提高检测的灵敏度, 其检测限可达 ng 甚至pg 水平, 可 做定量测定。 2、特异性强。ELI SA的每一步体的特异性识别过程, 结 构类似物、 有色物质、 荧光物质等对检测的影响很小。 3、样品的预处理过程和 ELI SA的操作步骤简单快捷， 有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同 时检测数十甚至上百个样品。 4、设备简单，适用于基层。
ELISA的应用
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用 于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病 等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原 的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵 敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查 几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。 本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的 循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。
+ 固相抗体 标本
+ 酶标抗体
+ 底物
酶联免疫吸附试验ppt课件
显色原理
DH2 + H2O2
HRP
D
+
2H2O
（底物）
常用的供氢体： 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB ABTS
OPD（邻苯二胺）
OPD氧化后的产物呈明黄色，用酸终止酶反应 后，由橙红色转向棕黄色，在492nm处有最高
吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物
最常用的底物。
封闭液 6ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 样品稀释液(PBS) 4.5ml 兔血清 (已包被) 酶标抗体(HRP-Ab) 1.5ml 底物 4.5ml 终止液(H2SO4) 2ml
酶标板(已包被) 1块 锡 纸 1张 200l pipette 1把 Tip 若干 试管 7支 1ml吸管(配胶帽) 1支 培养箱43℃ 1台/室 吸水纸 若干 记号笔 1支
TMB有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。
注意事项
1.
加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，避免出 现气泡。 加样器头不能混用，尤其是吸酶和底物时，一定要换加 样器头。 底物应现用现配。
2.
3.
4.
5.
空白对照孔与阴性对照孔不加酶标抗体。
加样时注意酶标板的方向。
免疫标记技术的分类、原理及应用
空隙，从而防止非特异性吸附，影响结果
的准确性。如图：
封 闭 的 作 用
Coating
Blocking E
E
E
E
E
E
E
E
After blocking
Without blocking
最常用的封闭剂：
0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA） 10%的小牛血清 1%明胶
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7、洗板4次。
8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a) 工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。
10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合 工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟.
11 、洗板4次.
二、双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附
于固相载体，加入待检标本（含相应抗原） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和 底物显色进行测定（图2）。
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图2: 双抗体夹心法测抗原示意图
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6
第二部分: 常用实验方法
三、竞争法
此法常用于测抗原和半抗原，也用于测 抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于 固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原， 使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分 离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗 原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原 颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
125 62.5 pg/ml pg/ml
31.25 pg/ml
标准品稀释方法
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第四.四部分: 结果判断与计算
1、每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。 2、绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
• 1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至 室温。
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
酶联免疫吸附实验(ELISA)
山东省医学科学院基础所免疫室
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1
第一部分: 基本实验原理
基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相
载体上，并保持其免疫活性，将待检标本 和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体 表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤 的方法分离抗原抗体复合物和游离成分， 然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗 原或抗体的定性或定量检测。
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图3: 竞争法测抗原示意图
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第三部分: 方法的特点和进展
ELISA方法由于灵敏、特异，操作简便、 快速，实验设备要求较为简单，应用范围 广泛，无放射性污染等优点，成为目前普 及应用最广，发展最快的免疫学技术之一。 生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中 应用的常见技术（BAS-ELISA），其中 ABC- ELISA法更为常用，其基本原理为， 固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素 -酶标生物素复合物+底物显色。
12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。
13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。
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500μl std.
500μl 500μl 500μl 500μl 500μl
2000 pg/ml
1000 pg/ml
500 pg/ml
250 pg/ml
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第二部分: 常用实验方法
一、间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于
固相载体，加入待检标本（含相应抗体） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋 白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测 定（图1）。
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固相抗原 酶标抗抗体
待测标本(含相应抗体)
图1: 间接法测抗体示意图
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第二部分: 常用实验方法
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第四.二部分: 实验试剂、材料和仪器设备
• 实验标本 • 试剂盒及其内容物 • 实验材料 • 仪器设备
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实验标本
人外周血(血清) 1.收集血液的试管应为无热源和内毒素试管 2.血浆抗凝剂为EDTA 3.标本应清澈透明, 如有悬浮物应离心除去 4.避免溶血, 高血脂 5.标本收集后若不及时检测,按一次用量分装,冻存于
-20℃,避免反复冻融 6.可根据实际情况, 将标本作适当倍数稀释(建议做
预实验, 以确定稀释倍数)
标准品1支(4000pg，冻干)4℃ 1b 标准品和标本稀释液(粉红色) 1瓶(15ml)4℃ 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60μl)4℃ 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 ℃ 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60μl)4℃(避光) 3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4℃ 4 浓缩洗涤液 20×(兰色)1瓶(15ml)4℃ 5 显色剂1瓶(6ml)4℃ 6 终止液1瓶(12ml)4℃ 抗体包被板条8×12 或 8×6 4℃ 封板胶纸1张
说明书1份 *:[96/48 Test]
精心整理
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实验材料与设备
1.加样器: 0.5-10ul, 2-20ul, 20-200ul, 2001000ul
2.吸头: 10ul, 200ul,1000ul 3.酶标仪: 450nm 4.双蒸水或去离子水, 坐标纸等
精心整理
14
第四.三部分: 实验方法与步骤
精心整理
9
第四.一部分: 人TNF-α检测实验原理
基本实验原理: 双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包
被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与 单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素 化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α 抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反 应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的 显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A 值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过 绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。
8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a) 工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。
10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合 工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟.
11 、洗板4次.
二、双抗体夹心法 此法常用于测抗原。将已知抗体吸附
于固相载体，加入待检标本（含相应抗原） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和 底物显色进行测定（图2）。
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图2: 双抗体夹心法测抗原示意图
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第二部分: 常用实验方法
三、竞争法
此法常用于测抗原和半抗原，也用于测 抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于 固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原， 使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分 离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗 原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原 颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
125 62.5 pg/ml pg/ml
31.25 pg/ml
标准品稀释方法
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第四.四部分: 结果判断与计算
1、每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。 2、绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值
作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通 过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。 3、若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后 重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 4、试剂盒灵敏度：最小可测人TNF-a达4pg/ml。
• 1、提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至 室温。
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
酶联免疫吸附实验(ELISA)
山东省医学科学院基础所免疫室
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第一部分: 基本实验原理
基本原理 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相
载体上，并保持其免疫活性，将待检标本 和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体 表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤 的方法分离抗原抗体复合物和游离成分， 然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗 原或抗体的定性或定量检测。
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图3: 竞争法测抗原示意图
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第三部分: 方法的特点和进展
ELISA方法由于灵敏、特异，操作简便、 快速，实验设备要求较为简单，应用范围 广泛，无放射性污染等优点，成为目前普 及应用最广，发展最快的免疫学技术之一。 生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中 应用的常见技术（BAS-ELISA），其中 ABC- ELISA法更为常用，其基本原理为， 固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素 -酶标生物素复合物+底物显色。
12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。
13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。
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500μl std.
500μl 500μl 500μl 500μl 500μl
2000 pg/ml
1000 pg/ml
500 pg/ml
250 pg/ml
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第二部分: 常用实验方法
一、间接法 此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于
固相载体，加入待检标本（含相应抗体） 与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋 白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测 定（图1）。
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固相抗原 酶标抗抗体
待测标本(含相应抗体)
图1: 间接法测抗体示意图
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第二部分: 常用实验方法
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第四.二部分: 实验试剂、材料和仪器设备
• 实验标本 • 试剂盒及其内容物 • 实验材料 • 仪器设备
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实验标本
人外周血(血清) 1.收集血液的试管应为无热源和内毒素试管 2.血浆抗凝剂为EDTA 3.标本应清澈透明, 如有悬浮物应离心除去 4.避免溶血, 高血脂 5.标本收集后若不及时检测,按一次用量分装,冻存于
-20℃,避免反复冻融 6.可根据实际情况, 将标本作适当倍数稀释(建议做
预实验, 以确定稀释倍数)
标准品1支(4000pg，冻干)4℃ 1b 标准品和标本稀释液(粉红色) 1瓶(15ml)4℃ 2a 浓缩生物素化抗体2/1支*(60μl)4℃ 2b 生物素化抗体稀释液（绿色）（15ml）4 ℃ 3a 浓缩酶结合物2/1支*(60μl)4℃(避光) 3b 酶结合物稀释液(黄色)1瓶(15ml)4℃ 4 浓缩洗涤液 20×(兰色)1瓶(15ml)4℃ 5 显色剂1瓶(6ml)4℃ 6 终止液1瓶(12ml)4℃ 抗体包被板条8×12 或 8×6 4℃ 封板胶纸1张
说明书1份 *:[96/48 Test]
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实验材料与设备
1.加样器: 0.5-10ul, 2-20ul, 20-200ul, 2001000ul
2.吸头: 10ul, 200ul,1000ul 3.酶标仪: 450nm 4.双蒸水或去离子水, 坐标纸等
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第四.三部分: 实验方法与步骤
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第四.一部分: 人TNF-α检测实验原理
基本实验原理: 双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包
被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与 单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素 化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α 抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反 应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的 显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A 值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过 绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。