酶联免疫吸附测定
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
该技术的原理是利用特异性抗体与待测物发生特异性结合，通过酶的催化作用产生颜色反应或荧光信号，从而得到定量或半定量的结果。
下文将详细介绍ELISA的原理、反应步骤以及其应用领域。
一、ELISA的原理ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
它包括固定期（Coating）、阻断期（Blocking）、结合期（Binding）、洗涤期（Washing）和检测期（Detection）五个关键步骤。
1. 固定期（Coating）首先，在微孔板中将待测物固定在表面，这一步又称为固相抗原法。
通常使用多糖、蛋白质等具有反应性的物质将待测物固定在微孔板上。
固定完毕后，洗去多余的待测物。
2. 阻断期（Blocking）为避免非特异性结合和降低背景干扰，需要在上一步后加入阻断缓冲液，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼明胶等，使孔洞表面被占满，阻断非特异性吸附位点。
3. 结合期（Binding）加入待测样本和特异抗体，特异抗体可与待测物发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
一般将待测物样本加入微孔板后，经过一段时间的孵育，使抗原与特异抗体发生结合。
4. 洗涤期（Washing）在结合期后，需进行洗涤步骤以去除未结合的物质。
洗涤缓冲液通常使用含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液，洗涤次数及力度需充分保证去除干净。
5. 检测期（Detection）在洗涤期后，加入与特异抗体结合的酶标记二抗，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG。
经过孵育后，待测物与酶标记二抗形成复合物。
最后，加入底物使酶催化反应产生颜色或荧光信号。
二、ELISA的应用领域ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
1. 生物医学研究ELISA被用于检测生物样本中的特定蛋白质、肽、抗体和核酸等。
酶联免疫吸附测定法
酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产
物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷 酸酶(alkaline phosohatase, AP)。
酶的底物
1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，
最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4
终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶
一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物 为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。 用NaOH终止酶反应
阳性对照品(positive control)和阴性对照品 (negative control)
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
阴性对照品须先行检测，确定其中不含待 测物质。
阳性对照品在含蛋白保护剂的缓冲液中加 入一定量的待检物质 ，含量约为最低检测 敏感度的10~20倍。
洗涤液 常用的稀释液为含0.05%吐温20的磷酸
盐缓冲液。
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L
AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定(酶联免疫吸附剂测定,简称酶联测定)是一种用于检测生物分子浓度和活性的实验室方法,通常用于测定蛋白质、核酸、抗体等生物分子的浓度和活性。
酶联测定中,酶和吸附剂被固定在一起,形成一个酶-吸附剂复合物。
当生物分子通过这种复合物进入检测系统时,会被吸附在复合物上,并随着复合物的移动而被检测器检测到。
这种技术可以提高检测灵敏度和特异性,同时减少非特异性反应的干扰。
酶联测定中常用的吸附剂包括葡萄糖凝胶、磷酸凝胶、凝胶电泳剂等。
葡萄糖凝胶常用于检测蛋白质浓度,因为它可以吸附蛋白质,并且可以保持蛋白质的稳定性和流动性,使得蛋白质的检测更加高效和准确。
磷酸凝胶常用于检测核酸浓度和活性,因为它可以吸附核酸,并且可以提高核酸的分辨率和检测效率。
凝胶电泳则常用于检测抗体的浓度和活性,因为它可以检测抗体的特异性和灵敏度,并且可以分离和纯化抗体。
除了吸附剂和酶的选择外,酶联测定的制备和检测过程也需要一定的技术和知识。
例如,需要对吸附剂和酶进行适当的配对和融合,以保证吸附剂和酶的稳定性和活性。
还需要对检测系统进行优化和校准,以确保其准确性和可靠性。
酶联测定是一种高效、灵敏、准确的生物分子检测方法,可以用于测定多种生物分子的浓度和活性,包括蛋白质、核酸、抗体等。
随着酶联测定技术的不断发展和完善,它将成为生物学研究和实验室分析中不可或缺的工具。
酶联免疫吸附测定名词解释
酶联免疫吸附测定名词解释酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种用于检测生物样本中特定抗原或抗体的定量分析方法。
该方法结合了免疫学技术和酶学技术，可广泛应用于临床诊断、药物研发和生物学研究等领域。
ELISA的基本原理是利用特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）结合，在固定的固相支持物上进行特异性结合。
通常情况下，ELISA方法包括四个主要步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
1.涂覆：将特异性抗体或待测物质固定在微孔板的底部或其他固相材料上。
涂覆后，待测物质能够与后续加入的样本中的抗原或抗体结合。
2.孵育：将待测样本加入到涂覆好的微孔板中，样本中的抗原或抗体能够与固定在底部的特异性抗体结合。
3.洗涤：通过反复加入缓冲液并倒掉的方法，去除非特异性结合的物质，以减少干扰。
4.检测：加入与被测抗原或抗体结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。
随后，再加入酶底物，使酶催化产生反应物。
根据反应物的产生量，可以定量测定待测物的浓度。
ELISA方法使用方便、操作简单，能够高效地进行大规模样本的处理和分析。
根据具体的检测目的和待测物质性质的不同，ELISA方法可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等不同类型。
此外，近年来还发展了一些改进的ELISA方法，如荧光ELISA和化学发光ELISA等。
ELISA方法在临床诊断中广泛应用，可以用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标记物等。
此外，ELISA方法还可以用于药物研发，如筛选药物靶点、评估药物吸收、分布、代谢和排泄等。
在生物学研究中，ELISA方法可以用于分析蛋白质相互作用、表达水平的检测和鉴定、细胞因子测定等。
酶联免疫吸附实验实验报告
酶联免疫吸附实验实验报告一、实验目的酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种常用的免疫学检测技术，本实验旨在通过实际操作，掌握 ELISA 的基本原理、操作步骤和结果分析方法，检测样本中特定抗原或抗体的含量。
二、实验原理ELISA 的基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）表面，然后加入待测样品，使其与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标抗体复合物。
最后，加入底物，通过酶催化底物显色，根据显色的程度来定量或定性分析待测样品中抗原或抗体的含量。
三、实验材料与设备1、材料待测样品：＿____标准品：＿____包被抗体：＿____酶标抗体：＿____底物溶液：＿____洗涤液：＿____终止液：＿____2、设备酶标仪微量移液器恒温培养箱聚苯乙烯微量反应板四、实验步骤1、包被将包被抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度，加入聚苯乙烯微量反应板的孔中，每孔100 μL，4℃过夜。
2、封闭次日，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤 3 次，每次 3 分钟。
然后每孔加入200 μL 封闭液，37℃孵育 1 小时。
3、加样弃去封闭液，洗涤 3 次。
将待测样品和标准品用稀释液稀释至适当浓度，分别加入孔中，每孔100 μL，37℃孵育 1 小时。
4、加酶标抗体弃去孔内液体，洗涤 3 次。
每孔加入100 μL 酶标抗体，37℃孵育 1 小时。
5、显色弃去孔内液体，洗涤 3 次。
每孔加入100 μL 底物溶液，37℃避光孵育 15 30 分钟，直至显色明显。
6、终止反应每孔加入50 μL 终止液，终止反应。
7、测定吸光度使用酶标仪在 450 nm 波长处测定各孔的吸光度值。
五、实验结果1、标准曲线的绘制以标准品的浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、待测样品浓度的计算根据待测样品的吸光度值，在标准曲线上查出其对应的浓度。
六、结果分析1、准确性分析将测定结果与已知标准值进行比较，计算相对误差，评估实验的准确性。
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫分析技术，用于检测和定量分析特定蛋白质或其它
分子的存在。
这种分析方法是基于抗原与抗体的高度特异性结合原理。
以下是酶联免疫吸附法的一般标准步骤：
1. 准备微孔板：将酶标板的孔洞涂覆有抗原或抗体，使其吸附
在微孔板上。
2. 样本处理：将待检样本经过必要的预处理，如稀释、清洗等。
3. 加入样本：将处理好的样本加入到微孔板中，使抗原或抗体
与样本中的目标物质结合。
4. 免洗步骤：根据实验需要，可能需要进行一些免洗步骤来清
除非特异性结合物质。
5. 加入检测抗体：加入检测抗体，用于与目标物质结合。
6. 再次免洗步骤：如有需要，进行免洗步骤来清除非特异性结
合物质。
7. 加入酶标记抗体：加入酶标记抗体，它与检测抗体结合形成
复合物。
8. 加入底物：加入底物，使酶作用并产生可测量的信号。
9. 反应停止：加入反应终止剂停止酶反应，停止信号产生。
10. 信号检测：使用酶标仪或其他测量设备测量底物反应产生的
信号强度。
11. 数据分析：根据标准曲线或其他定量方法，计算样品中目标
物质的浓度。
需要注意的是，ELISA的具体步骤可能会因实验目的、样品类型
等因素有所差异，以上所述仅为一般标准步骤。
酶联免疫吸附试验
技术创新：新型的酶联免疫吸附试验技术不断涌现如荧光标记技术、量子点标记技术等提高了检测的灵敏度和特异性。
市场需求：随着生物技术的不断发展酶联免疫吸附试验在临床诊断、食品安全、生物医药等领域的需求不断增长。
发展趋势：随着检测技术的不断进步酶联免疫吸附试验将朝着更快速、更准确、更自动化的方向发展。
应用领域拓展：酶联免疫吸附试验的应用领域不断拓展如肿瘤标志物检测、病毒检测、食品安全检测等为各领域的发展提供了有力支持。
荧光标记技术：提高灵敏度降低背景干扰
磁珠分离技术：快速分离抗原抗体提高试验速度
酶联免疫吸附试验在交叉学科领域的应用前景
酶联免疫吸附试验在生物医学领域的应用
酶联免疫吸附试验在环境监测领域的应用
酶联免疫吸附试验在农业科技领域的应用
酶联免疫吸附试验在食品安全检测领域的应用
酶联免疫吸附试验的市场需求与发展趋势
联合检测：将酶联免疫吸附试验与其他检测方法相结合提高检测的灵敏度和特异性。
标准化和规范化：建立酶联免疫吸附试验的标准化和规范化操作流程确保试验结果的准确性和可靠性。
酶联免疫吸附试验的发展趋势
PRT SIX
酶联免疫吸附试验的技术创新与突破
自动化技术：提高试验效率降低人为误差
微孔板技术：简化操作减少样本用量
PRT TWO
酶联免疫吸附试验的定义
酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫分析技术
通过酶与抗体或抗原的结合实现对目标分子的定量或定性检测
酶可以放大信号提高检测的灵敏度和特异性
酶联免疫吸附试验广泛应用于生物学、医学等领域
酶联免疫吸附试验的原理
洗涤去除未结合的成分后加入底物显色通过颜色反应判断待测物的浓度。
阻断酶联免疫吸附试验：将抗体先固定在固相载体上再用酶标记的抗原进行检测最后加入底物显色。
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操作步骤
每种液体均加100ul
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 37 ℃ 30min
加待检抗体：倍比稀释的兔抗 鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
E
E
→
洗涤：3次， 1min/次
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
E
D+ 2H2O
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。
酶 /E
辣根过氧化物酶
底 物/DH2
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS（磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒
ELISA法筛查α-地中海贫血 ELISA法定量检测乙肝抗原两对半
……
基础医学领域的应用 ----ELISA试剂盒商业资讯
ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
法医物证
……
环境卫生
酶催化底物液显色
DH2+ H2O2
（三）双抗体夹心法
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和 制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
（四）竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体。 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不 能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药 物等ELISA测定多用此法。
E
E
→
洗涤：3次， 1min/次
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
→
终止液终止显色
加酶标抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体 反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
同位素131I标记抗体指示小鼠肿瘤
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长
（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。
结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅
待检样品孔显色明显 空白对照
ELISA标准曲线
Ab浓度（ng/ml）
注意事项
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光
测定波长
nm
492 460 449 425 642
400 500 405 420 360,450
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖苷
酶
黄色
420
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。 根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
操作步骤
每种液体均加100ul／孔
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 37 ℃ ，20min
加待检抗体：倍比稀释的兔抗 鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELI抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
倍比稀释法与加样
样 品 管 100µ L 第 一 管 100µ L第 二 管 100µ L第 十 管
S
600µ L
300µ L
300µ L
300µ L
1:400 A B 1 2 3
1:1600
1:6400
…….
4
5
6
7
8
9
10
11
每孔100ul,上下两排一致
从低浓度往 高浓度加,
12 blank
ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
（一）直接法
（二）间接法
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗体 以检测已与固相结合 的受检抗体，故称为 间接法。 其优点在于只要 变换包被抗原就可利 用同一酶标抗抗体建 立检测相应抗体的方 法。可用于传染病的 诊断。
倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高 浓度方向进行
终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 将加样枪调到最大量程（见加样枪顶部数字） 将所有剩余液体倒入水池，所有塑料制品开盖回 收到讲台
需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
免 疫 荧 光 技 术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
课程内容
ELISA的原理
ELISA的分类
间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例
ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化
E
3.抗原或抗体的酶标记
间接ELISA