酶联免疫吸附测定法(elisa法)
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab 的解离程度与K值有关。
ELISA检测方法
ELISA检测方法ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物科学及环境科学等领域。
该方法利用抗体和酶的相互作用，能够检测和测定特定抗原或抗体的存在和浓度。
下面将详细介绍ELISA的原理、步骤、应用以及优缺点。
ELISA的原理主要基于抗原-抗体结合的原理。
首先，在固体表面（晶髓酶标板等）上吸附或共价结合抗原，形成抗原固相。
然后，将待测样品加入酶标板孔中与固定的抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物。
随后加入特异性的酶标记抗体，使其与复合物形成二抗三重复合物。
最后，通过添加底物，酶催化底物产生可检测的色变反应，测定抗原或抗体的浓度。
1.抗原固定：将已知浓度的抗原加入酶标板中，并使其吸附在固体表面，形成抗原固相。
固相吸附通常通过物理吸附或共价结合实现。
2.试样加入：将待测样品加入酶标板中与固定抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物。
通常需要对样品进行初步处理，如稀释、加入染色剂等。
3.二抗加入：将特异性酶标记的二抗加入酶标板中，与复合物发生特异性反应，形成二抗三重复合物。
4.清洗：通过洗涤剂将非特异性结合物洗去，以减少干扰。
5.基质加入：加入特定底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯二胺）或ABTS（2,2'-联氨基二（2-甲基丙酰氧）乙烷磺酸铵），酶催化产生彩色反应。
6.反应停止：用酸、碱或金属离子等停止反应，阻断底物的氧化反应，维持产色稳定。
7.反应测定：使用光度计测定产生的色素的吸光度或荧光。
ELISA具有广泛的应用。
在医学领域，ELISA常用于检测血液中的抗体和抗原，从而诊断传染病、自身免疫疾病等。
在生物科学研究中，ELISA可用于测定细胞因子、蛋白质等生物大分子的浓度。
此外，ELISA也可以用于检测环境样品中的污染物，如重金属、农药等。
1.灵敏度高：ELISA可以检测到较低浓度的抗原或抗体，常常超过其他方法的敏感度。
2.特异性强：ELISA利用特异性抗体进行识别，可准确检测特定的抗原或抗体。
ELISA
酶联免疫吸附试验（ELISA）作者：发布日期：(2009-05-31) 浏览次数：7次酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种固相酶免疫测定技术。
它的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
ELISA的主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。
试剂准备1．包被液（碳酸盐缓冲液pH9.6）：Na2CO3 1.59g；NaHCO3 2.93g；加800ml水溶解，定容至1000ml加0.02%NaN3，0.22μm膜过滤，4℃保存。
2．洗涤缓冲液（PBST）：NaCl 9g；KCl 0.25g；Na2HPO4 3.63g；KH2PO4 0.25g；加水溶解，定容至1000ml加0.2% Tween20混匀。
3．封闭液：10%小牛血清（1ml小牛血清加到9ml 1×PBS中混匀）。
4．底物缓冲液（磷酸盐-柠檬酸缓冲液pH6.0）：Na2HPO4 56.77g；柠檬酸5.6g；加水800ml溶解，定容至1000ml，过滤0.22μm膜，4℃保存。
5．终止液：1mol/L H2SO4。
一、双抗体夹心法检测抗原双抗体夹心法用于检测抗原。
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
酶联免疫吸附实验(ELISA)1.实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
2.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附测定名词解释
酶联免疫吸附测定名词解释酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种用于检测生物样本中特定抗原或抗体的定量分析方法。
该方法结合了免疫学技术和酶学技术，可广泛应用于临床诊断、药物研发和生物学研究等领域。
ELISA的基本原理是利用特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）结合，在固定的固相支持物上进行特异性结合。
通常情况下，ELISA方法包括四个主要步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
1.涂覆：将特异性抗体或待测物质固定在微孔板的底部或其他固相材料上。
涂覆后，待测物质能够与后续加入的样本中的抗原或抗体结合。
2.孵育：将待测样本加入到涂覆好的微孔板中，样本中的抗原或抗体能够与固定在底部的特异性抗体结合。
3.洗涤：通过反复加入缓冲液并倒掉的方法，去除非特异性结合的物质，以减少干扰。
4.检测：加入与被测抗原或抗体结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。
随后，再加入酶底物，使酶催化产生反应物。
根据反应物的产生量，可以定量测定待测物的浓度。
ELISA方法使用方便、操作简单，能够高效地进行大规模样本的处理和分析。
根据具体的检测目的和待测物质性质的不同，ELISA方法可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等不同类型。
此外，近年来还发展了一些改进的ELISA方法，如荧光ELISA和化学发光ELISA等。
ELISA方法在临床诊断中广泛应用，可以用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标记物等。
此外，ELISA方法还可以用于药物研发，如筛选药物靶点、评估药物吸收、分布、代谢和排泄等。
在生物学研究中，ELISA方法可以用于分析蛋白质相互作用、表达水平的检测和鉴定、细胞因子测定等。
酶联免疫吸附法实验步骤
酶联免疫吸附法实验步骤酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样品中特定的抗原或抗体。
以下是ELISA实验的基本步骤。
步骤1：制备试样首先，需要准备样品，可以是血清、细胞上清、尿液等。
样品可能含有目标抗原或抗体，也可能含有其他干扰物质。
样品的准备过程通常包括离心、稀释等步骤，以获得适合实验的样品。
步骤2：涂布固相材料ELISA试验通常使用微孔板（96孔板），每个孔都涂布有特定的抗原或抗体。
涂布的过程包括将抗原或抗体溶液加入每个孔中，并在适当的条件下孵育一段时间，使其吸附在固相材料上。
步骤3：阻断非特异性结合为了降低非特异性背景信号，需要在涂布后阻断孔中未被特异性结合的部分。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA），牛阴离子解脂磷酸酰胆碱（BSA-PIPC），非脂阻断剂（Nonfat blocking reagent）等。
阻断剂溶液通常加入每个孔，孵育一段时间，然后将其倒出。
步骤4：加入样品与控制品经过阻断后，样品和控制品被加入每个孔中，以检测其中的特定抗原或抗体。
每个孔可以添加不同浓度的样品和控制品，以建立浓度-效应曲线。
步骤5：孵育与洗涤样品和控制品孵育的时间和温度因实验设计而异。
在孵育过程中，抗原或抗体与样品中的目标分子发生特异性结合。
完成孵育后，需要进行洗涤以去除未结合的物质，减少背景干扰。
洗涤缓冲液通常用洗板机进行，该步骤重复数次。
步骤6：加入检测抗体经过洗涤后，需要加入与样品中目标分子特异结合的检测抗体。
检测抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶HRP）偶联，以便在后续步骤中进行信号放大。
加入的检测抗体需要与目标分子特异性结合，并在适当的条件下孵育。
步骤7：加入底物经过检测抗体孵育后，需要加入底物以触发酶催化反应。
底物的选择取决于所使用的酶和反应类型。
例如，在HRP酶联ELISA中，一种常用的底物为TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基胺）。
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验
四、全自动酶免工作站
1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件）
医院 计生站 疾控中心
全自动--从加样、孵育、洗涤到数据处理打印报告都由仪器自动完成； 无污染--直接使用原样本试管和原试剂瓶，消除生物污染和试剂污染； 高效率--一次性处理样本量大；
酶联免疫吸附试验
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述
▲ 基本原理： 抗原抗体的特异性结合以及抗SA）概述
酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定 是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量 成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的颜色反应的深浅绘制标准曲线并 依此计算出未知样品中抗体或抗原的浓度。
从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生 特异性反应的物质。
抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相 应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶结合物：酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产物,它不仅 具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化酶促反应，显示出生物放大作用。
（药品冷藏箱（2~8℃）） 结果分 析
吸光度 测量
孵育
加入终 止液
酶联免疫吸附试验
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测
天平
粉碎机
电动振荡器
移液器
酶联免疫吸附试验
离心机
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。
即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
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加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法 间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
例如乙肝病毒中的 表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗 体（HBcAg），虽来源于 同一病毒，但仅与其相 应的抗体结合，而不与 另外两种抗体反应。抗 原抗体反应的这种特异 性使免疫测定能在一非 常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某 一特定的物质，而不需 先分离待检物。
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖 苷酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
（一）双抗体夹心法ห้องสมุดไป่ตู้
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质
其所生成的颜色深浅与 欲测的抗原（抗体）含量成 正比。
这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜、电子显微镜观 察，也可以用分光光度计 （酶标仪）加以测定。
其方法简单，方便讯速， 特异性强。
二、酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
用已知特异性 抗体包被 固相载体
一、基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待 测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上， 但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原） 与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保 留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体 上的抗原（抗体）反应结合后， 再加上酶 的相应底 物，即起 催化水解 或氧化还 原反应而 呈颜色。
什么是 酶联免疫分析技术
ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特 点 ELISA的应用实例
1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷 兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免 疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免 疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领 域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分 析方法，是在免疫酶技术 ( immunoenzymatic techniques ) 的基础 上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。
特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告集团的 酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少 量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可 供观察的显色反应现象。因此该体系常被称 为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在 微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时， 化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应 测定法的敏感度约为5~10μg/ml 。
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别洗涤 除去未结合 的成分
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
生物体系中的化学测量
酶联免疫吸附测定法
裴丹青03081152
复杂生物体系中生命物质的化学测量是揭示 生命奥秘的重要手段，在食品检验、疾病诊断和 预防的过程中也日益凸现其重要作用。 经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、 简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测 对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂 且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。 于是，一系列针对生物体系中化学成分的测 量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它 将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体 系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。