酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法(elisa法)
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法 间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体
特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的 抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互 补关系，所以抗原抗体反应具有高度的 特异性。
例如乙肝病毒中的 表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗 体（HBcAg），虽来源于 同一病毒，但仅与其相 应的抗体结合，而不与 另外两种抗体反应。抗 原抗体反应的这种特异 性使免疫测定能在一非 常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某 一特定的物质，而不需 先分离待检物。
酶
辣根过氧化物酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖 苷酶
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
该技术的原理是利用特异性抗体与待测物发生特异性结合，通过酶的催化作用产生颜色反应或荧光信号，从而得到定量或半定量的结果。
下文将详细介绍ELISA的原理、反应步骤以及其应用领域。
一、ELISA的原理ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
它包括固定期（Coating）、阻断期（Blocking）、结合期（Binding）、洗涤期（Washing）和检测期（Detection）五个关键步骤。
1. 固定期（Coating）首先，在微孔板中将待测物固定在表面，这一步又称为固相抗原法。
通常使用多糖、蛋白质等具有反应性的物质将待测物固定在微孔板上。
固定完毕后，洗去多余的待测物。
2. 阻断期（Blocking）为避免非特异性结合和降低背景干扰，需要在上一步后加入阻断缓冲液，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼明胶等，使孔洞表面被占满，阻断非特异性吸附位点。
3. 结合期（Binding）加入待测样本和特异抗体，特异抗体可与待测物发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
一般将待测物样本加入微孔板后，经过一段时间的孵育，使抗原与特异抗体发生结合。
4. 洗涤期（Washing）在结合期后，需进行洗涤步骤以去除未结合的物质。
洗涤缓冲液通常使用含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液，洗涤次数及力度需充分保证去除干净。
5. 检测期（Detection）在洗涤期后，加入与特异抗体结合的酶标记二抗，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG。
经过孵育后，待测物与酶标记二抗形成复合物。
最后，加入底物使酶催化反应产生颜色或荧光信号。
二、ELISA的应用领域ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
1. 生物医学研究ELISA被用于检测生物样本中的特定蛋白质、肽、抗体和核酸等。
酶联免疫吸附筛查法
酶联免疫吸附筛查法酶联免疫吸附筛查法（Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种常用的实验室技术，用于检测和定量分析体内特定抗原或抗体的存在。
该技术结合了酶学和免疫学的原理，通过酶与抗原或抗体的特异性结合反应，将抗原或抗体检测的结果转化为颜色或荧光信号，从而实现对目标物的快速、准确的筛查。
ELISA技术的原理是基于抗原与抗体之间的特异性结合反应。
首先，将待测的抗原或抗体溶液加入到特定的酶标板孔中，使其与酶标抗体预先固定在孔中的抗原或抗体发生结合。
然后，经过一系列的洗涤步骤，去除未结合的物质。
接下来，加入含有特异性抗体的酶标抗体溶液，使其与孔中已结合的抗原或抗体形成抗原-抗体复合物。
再次进行洗涤步骤，去除未结合的酶标抗体。
最后，加入酶底物，酶与酶底物反应产生可测量的色素或荧光信号。
通过测量反应产生的信号的强度，可以定量地测定样品中抗原或抗体的浓度。
ELISA技术在医学诊断、生物学研究和药物开发等领域得到了广泛的应用。
在医学诊断中，ELISA常用于检测和筛查疾病标志物，如病毒抗体、癌症抗原、药物残留物等。
在生物学研究中，ELISA可用于检测和定量分析细胞因子、激素、生长因子等生物活性物质。
在药物开发中，ELISA可用于药物代谢和药物动力学研究，评估药物的药效和药物浓度。
ELISA技术的优点之一是其高灵敏度和高特异性。
由于ELISA采用双抗体夹心法，即在特定抗原或抗体的两侧分别固定特异性抗体，从而增加了目标物与抗体的结合机会，提高了检测的灵敏度。
此外，ELISA可以同时检测多个样品，节省了时间和成本。
此外，ELISA的结果可以通过颜色或荧光信号的定量测量，使结果更加可靠和准确。
然而，ELISA技术也存在一些限制。
首先，ELISA对样品的处理和操作要求较高，操作流程较为繁琐，需要严格控制实验条件。
其次，ELISA对抗体的选择非常重要，需要具有高亲和力和高特异性的抗体，以确保准确的检测结果。
酶联免疫吸附筛查法
酶联免疫吸附筛查法酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA) 利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
测定抗原主要有：1、竞争法（Competition method）：本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程，称为包被 （Coated），也可叫做致敏。
经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。
这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。
该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。
但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。
2、双抗体夹心法：本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。
酶联免疫吸附测定名词解释
酶联免疫吸附测定名词解释酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种用于检测生物样本中特定抗原或抗体的定量分析方法。
该方法结合了免疫学技术和酶学技术，可广泛应用于临床诊断、药物研发和生物学研究等领域。
ELISA的基本原理是利用特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）结合，在固定的固相支持物上进行特异性结合。
通常情况下，ELISA方法包括四个主要步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
1.涂覆：将特异性抗体或待测物质固定在微孔板的底部或其他固相材料上。
涂覆后，待测物质能够与后续加入的样本中的抗原或抗体结合。
2.孵育：将待测样本加入到涂覆好的微孔板中，样本中的抗原或抗体能够与固定在底部的特异性抗体结合。
3.洗涤：通过反复加入缓冲液并倒掉的方法，去除非特异性结合的物质，以减少干扰。
4.检测：加入与被测抗原或抗体结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。
随后，再加入酶底物，使酶催化产生反应物。
根据反应物的产生量，可以定量测定待测物的浓度。
ELISA方法使用方便、操作简单，能够高效地进行大规模样本的处理和分析。
根据具体的检测目的和待测物质性质的不同，ELISA方法可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等不同类型。
此外，近年来还发展了一些改进的ELISA方法，如荧光ELISA和化学发光ELISA等。
ELISA方法在临床诊断中广泛应用，可以用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标记物等。
此外，ELISA方法还可以用于药物研发，如筛选药物靶点、评估药物吸收、分布、代谢和排泄等。
在生物学研究中，ELISA方法可以用于分析蛋白质相互作用、表达水平的检测和鉴定、细胞因子测定等。
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫分析技术，用于检测和定量分析特定蛋白质或其它
分子的存在。
这种分析方法是基于抗原与抗体的高度特异性结合原理。
以下是酶联免疫吸附法的一般标准步骤：
1. 准备微孔板：将酶标板的孔洞涂覆有抗原或抗体，使其吸附
在微孔板上。
2. 样本处理：将待检样本经过必要的预处理，如稀释、清洗等。
3. 加入样本：将处理好的样本加入到微孔板中，使抗原或抗体
与样本中的目标物质结合。
4. 免洗步骤：根据实验需要，可能需要进行一些免洗步骤来清
除非特异性结合物质。
5. 加入检测抗体：加入检测抗体，用于与目标物质结合。
6. 再次免洗步骤：如有需要，进行免洗步骤来清除非特异性结
合物质。
7. 加入酶标记抗体：加入酶标记抗体，它与检测抗体结合形成
复合物。
8. 加入底物：加入底物，使酶作用并产生可测量的信号。
9. 反应停止：加入反应终止剂停止酶反应，停止信号产生。
10. 信号检测：使用酶标仪或其他测量设备测量底物反应产生的
信号强度。
11. 数据分析：根据标准曲线或其他定量方法，计算样品中目标
物质的浓度。
需要注意的是，ELISA的具体步骤可能会因实验目的、样品类型
等因素有所差异，以上所述仅为一般标准步骤。
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法标准一、概述酶联免疫吸附法是一种常用的生物检测方法，用于测定抗原或抗体。
该方法具有高灵敏度、特异性和准确性等特点，广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测等领域。
本文将介绍酶联免疫吸附法的原理、试剂和操作步骤等标准要求。
二、原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是基于抗原抗体反应的检测方法。
在固相载体上标记特异性抗原或抗体，与样品中的靶分子结合后，再加入酶标记的抗靶分子抗体，最后通过底物显色反应观察结果。
根据颜色深浅程度可以判断样本中靶分子的浓度。
三、试剂1. 特异性抗原或抗体的纯化溶液：需经过质量控制，确保其准确性和特异性。
2. 酶标抗体的纯化溶液：应选择合适的酶标记抗体，以增强颜色反应的敏感性。
3. 洗涤液：用于去除实验过程中产生的非特异性结合物质。
4. 底物及终止液：用于颜色反应，可根据需要配置不同颜色的底物和终止液。
5. 其他所需辅助试剂：如缓冲液、防腐剂等。
四、操作步骤1. 准备试剂和设备：按照试剂说明书准备好所有试剂和设备，并确保仪器正常运行。
2. 包被抗原或抗体：将特异性抗原或抗体包被在固相载体上，制备成酶标板。
3. 加样：分别加入待测样品、标准品和阴性对照品，每个样品需设复孔。
4. 温育：将酶标板放置在恒温水浴中保温一定时间，使抗原抗体反应充分进行。
5. 洗涤：用洗涤液清洗酶标板表面，去除非特异性结合物质。
6. 添加底物：加入酶标抗体，继续温育并洗涤。
7. 显色反应：加入底物溶液，观察并记录颜色变化。
8. 终止反应：加入终止液，停止显色反应。
9. 检测与分析：用酶标仪测量各孔的光密度值，根据标准曲线的绘制得出待测样品中靶分子的浓度。
五、注意事项1. 应严格控制试剂和样本的质量，确保实验结果的准确性。
2. 在操作过程中应注意无菌操作，避免污染。
3. 洗涤时应彻底，以免影响实验结果。
4. 注意观察显色反应的时间和颜色深度，以确保实验过程的顺利进行。
5. 对于特殊样本（如血浆、组织匀浆液等），应在实验前进行处理，以保证实验结果的可靠性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。
高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。
解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。
2.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。
2.1.3最适比例只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。
以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）图（1）该理论的支持者网格学说，其成立的三个条件：➢抗原多价，抗体双价；➢二则比例合适；➢Ag/Ab过剩。
当抗原抗体浓度比例合适时，抗体的两个Fab段分别结合两个Ag分子，相互交叉结合连接成巨大的网格状立体聚合物，沉淀可见，如图b。
Ab/Ag过剩时，过剩方的结合价得不到饱和，大多数游离存在，只形成小分子复合物，沉淀不可见，如图a，c，d。
图（2）2.1.4敏感性化学比色法的敏感度为mg/mL水平；酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/mL；免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应相仿；标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mL水平。
如HBsAg，其敏感度可达0.1ng/mL。
2.2免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成分，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可测试标本中的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。
3.ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：➢免疫吸附剂：固相的抗原或抗体；➢结合物：酶标记的抗原或抗体；➢底物：酶催化的此物。
常见的检测方法有：双抗体夹心测抗原、3.1双抗体夹心法测抗原：图（3）此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可以用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
3.2双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶标结合物。
此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。
乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。
本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
3.3间接法测抗体间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
3.4竞争法测抗体图（4）当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。
3.5竞争性测抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作为夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。
标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，最后显色也越浅。
小分子激素、药物等多用此法。
3.6捕获包被法测抗体以IgM抗体为例。
血清中针对某些抗原的特异性IgM常和非特异性IgM，以及特异性IgG 同时存在，后者会干扰IgM的测定。
捕获法则较好地解决了上述问题，其原理是先用抗人IgM（μ链）抗体包被固相载体，使血清中所有IgM(包括特异性与非特异性IgM)均固定在固相上，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。
此方法目前主要用于检测各类早期感染的特异性抗体IgM。
3.7ABS-ELISA法ABS为亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）的略语。
亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。
生物素为小分子化合物，分子量244。
用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。
生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。
由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。
两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。
在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。
在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。
从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。
由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。
4.ELISA试剂的组成ELISA试剂中有三个必要的组成部分：免疫吸附、结合物、酶的底物。
常见的组成如下：➢已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；➢酶标记的抗原或抗体（结合物）；➢酶的底物；➢阴性对照品或阳性对照品，参考标准品；➢结合物及标本的稀释液；➢洗涤液；➢酶反应终止液；4.1固相载体：聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍能保留原来的免疫学活性。
聚氯乙烯，对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一条各孔之间性能相近。
4.2包被的方式将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被。
蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。
这种物理吸附是非常特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
不易吸附的非蛋白质抗原，可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。
亲和素生物素，即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质，无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA 板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。
优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性也好，抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至1/100。
4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。
一般只含有一个抗原决定簇，纯度高、特异性也高。
但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。
借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
包被用抗体：IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联接发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。
取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。
腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。
在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
4.4包被的条件：Ph9.6碳酸盐缓冲液；pH7.2磷酸盐缓冲液；Ph7-8 Tris-HCl缓冲液；加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。
包被浓度随载体和包被物的性质可能有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。
一般蛋白质的包被浓度为10ng/mL-20ug/mL。
封闭：在包被后，用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
封闭让大量无关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后步骤中干扰物质的再吸附。
常用的封闭剂：0.05%-0.5%BSA；10%的小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可以用高浓度（5%）。
4.5洗涤液：在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。
4.6结合物：即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂。
4.7酶的催化性；抗体（抗原）的免疫活性；含有或少含有游离的抗体（或抗原）；结合物要有良好的稳定性。
结合物用的抗原和抗体制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他蛋白的干扰。
最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本地浅淡。
在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。
酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。
酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。
在ELISA中有HRP,AP,葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。
4.8结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。