酶联免疫吸附测定
酶联免疫吸附测定实验报告
酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中特定分子的存在。
本实验旨在通过ELISA技术，对特定抗原在样本中的含量进行测定，并了解其原理及应用。
一、实验原理ELISA技术是一种基于免疫反应的实验方法，其原理主要包括固相吸附、特异性结合、酶标记和显色反应。
首先，在微孔板中固定特异性抗体，形成固相吸附。
然后，加入待测样本，样本中的目标抗原与固相抗体结合。
接着，加入酶标记的二抗与目标抗原结合，形成特异性结合。
最后，通过添加显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化，从而定量分析目标抗原的含量。
二、实验步骤1. 准备样本和试剂：收集待测样本，如血清、尿液或细胞培养上清液，并准备好ELISA试剂盒中的各种试剂。
2. 板洗涤：将微孔板放入洗板机中，加入洗板缓冲液，进行洗涤步骤，以去除未结合的物质。
3. 固相吸附：将特异性抗体加入微孔板孔中，孵育一段时间，使其与固相吸附。
4. 样本孵育：将待测样本加入各孔中，与固相抗体结合，在恒温条件下孵育。
5. 二抗结合：加入酶标记的二抗，与目标抗原结合形成特异性结合。
6. 洗涤：再次进行洗板步骤，去除未结合的物质。
7. 底物反应：加入显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化。
8. 反应终止：加入终止液，停止酶催化反应。
9. 测定吸光度：使用酶标仪测定各孔的吸光度值。
10. 数据分析：根据吸光度值，绘制标准曲线，通过比较待测样本的吸光度值，计算出目标抗原的浓度。
三、实验结果通过ELISA实验，我们成功测定了待测样本中目标抗原的含量。
根据标准曲线，我们计算出了各样本中目标抗原的浓度。
这些结果将有助于我们了解样本中特定分子的水平，从而进一步研究其生物学功能和相关疾病的发生机制。
四、实验应用ELISA技术具有广泛的应用领域，包括生物医学研究、临床诊断、药物开发等。
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
该技术的原理是利用特异性抗体与待测物发生特异性结合，通过酶的催化作用产生颜色反应或荧光信号，从而得到定量或半定量的结果。
下文将详细介绍ELISA的原理、反应步骤以及其应用领域。
一、ELISA的原理ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
它包括固定期（Coating）、阻断期（Blocking）、结合期（Binding）、洗涤期（Washing）和检测期（Detection）五个关键步骤。
1. 固定期（Coating）首先，在微孔板中将待测物固定在表面，这一步又称为固相抗原法。
通常使用多糖、蛋白质等具有反应性的物质将待测物固定在微孔板上。
固定完毕后，洗去多余的待测物。
2. 阻断期（Blocking）为避免非特异性结合和降低背景干扰，需要在上一步后加入阻断缓冲液，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼明胶等，使孔洞表面被占满，阻断非特异性吸附位点。
3. 结合期（Binding）加入待测样本和特异抗体，特异抗体可与待测物发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
一般将待测物样本加入微孔板后，经过一段时间的孵育，使抗原与特异抗体发生结合。
4. 洗涤期（Washing）在结合期后，需进行洗涤步骤以去除未结合的物质。
洗涤缓冲液通常使用含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液，洗涤次数及力度需充分保证去除干净。
5. 检测期（Detection）在洗涤期后，加入与特异抗体结合的酶标记二抗，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG。
经过孵育后，待测物与酶标记二抗形成复合物。
最后，加入底物使酶催化反应产生颜色或荧光信号。
二、ELISA的应用领域ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
1. 生物医学研究ELISA被用于检测生物样本中的特定蛋白质、肽、抗体和核酸等。
酶联免疫吸附测定法
酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产
物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷 酸酶(alkaline phosohatase, AP)。
酶的底物
1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，
最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4
终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶
一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物 为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。 用NaOH终止酶反应
阳性对照品(positive control)和阴性对照品 (negative control)
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
阴性对照品须先行检测，确定其中不含待 测物质。
阳性对照品在含蛋白保护剂的缓冲液中加 入一定量的待检物质 ，含量约为最低检测 敏感度的10~20倍。
洗涤液 常用的稀释液为含0.05%吐温20的磷酸
盐缓冲液。
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L
AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定(酶联免疫吸附剂测定,简称酶联测定)是一种用于检测生物分子浓度和活性的实验室方法,通常用于测定蛋白质、核酸、抗体等生物分子的浓度和活性。
酶联测定中,酶和吸附剂被固定在一起,形成一个酶-吸附剂复合物。
当生物分子通过这种复合物进入检测系统时,会被吸附在复合物上,并随着复合物的移动而被检测器检测到。
这种技术可以提高检测灵敏度和特异性,同时减少非特异性反应的干扰。
酶联测定中常用的吸附剂包括葡萄糖凝胶、磷酸凝胶、凝胶电泳剂等。
葡萄糖凝胶常用于检测蛋白质浓度,因为它可以吸附蛋白质,并且可以保持蛋白质的稳定性和流动性,使得蛋白质的检测更加高效和准确。
磷酸凝胶常用于检测核酸浓度和活性,因为它可以吸附核酸,并且可以提高核酸的分辨率和检测效率。
凝胶电泳则常用于检测抗体的浓度和活性,因为它可以检测抗体的特异性和灵敏度,并且可以分离和纯化抗体。
除了吸附剂和酶的选择外,酶联测定的制备和检测过程也需要一定的技术和知识。
例如,需要对吸附剂和酶进行适当的配对和融合,以保证吸附剂和酶的稳定性和活性。
还需要对检测系统进行优化和校准,以确保其准确性和可靠性。
酶联测定是一种高效、灵敏、准确的生物分子检测方法,可以用于测定多种生物分子的浓度和活性,包括蛋白质、核酸、抗体等。
随着酶联测定技术的不断发展和完善,它将成为生物学研究和实验室分析中不可或缺的工具。
酶联免疫吸附测定名词解释
酶联免疫吸附测定名词解释酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种用于检测生物样本中特定抗原或抗体的定量分析方法。
该方法结合了免疫学技术和酶学技术，可广泛应用于临床诊断、药物研发和生物学研究等领域。
ELISA的基本原理是利用特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）结合，在固定的固相支持物上进行特异性结合。
通常情况下，ELISA方法包括四个主要步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
1.涂覆：将特异性抗体或待测物质固定在微孔板的底部或其他固相材料上。
涂覆后，待测物质能够与后续加入的样本中的抗原或抗体结合。
2.孵育：将待测样本加入到涂覆好的微孔板中，样本中的抗原或抗体能够与固定在底部的特异性抗体结合。
3.洗涤：通过反复加入缓冲液并倒掉的方法，去除非特异性结合的物质，以减少干扰。
4.检测：加入与被测抗原或抗体结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。
随后，再加入酶底物，使酶催化产生反应物。
根据反应物的产生量，可以定量测定待测物的浓度。
ELISA方法使用方便、操作简单，能够高效地进行大规模样本的处理和分析。
根据具体的检测目的和待测物质性质的不同，ELISA方法可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等不同类型。
此外，近年来还发展了一些改进的ELISA方法，如荧光ELISA和化学发光ELISA等。
ELISA方法在临床诊断中广泛应用，可以用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标记物等。
此外，ELISA方法还可以用于药物研发，如筛选药物靶点、评估药物吸收、分布、代谢和排泄等。
在生物学研究中，ELISA方法可以用于分析蛋白质相互作用、表达水平的检测和鉴定、细胞因子测定等。
酶联免疫吸附测定法基本步骤
酶联免疫吸附测定法基本步骤酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测和定量测定抗原或抗体。
一、准备工作在进行酶联免疫吸附测定法之前，首先需要准备好实验所需的试剂和设备。
试剂包括抗原、抗体、酶标记物、底物和缓冲液等。
设备包括酶标仪、洗板机、离心机和显微镜等。
二、涂布抗原将待测的抗原溶液均匀涂布在免疫平板的孔中，然后放置在4℃的冰箱中过夜，使抗原能够牢固地吸附在孔中。
三、孔的处理将免疫平板从冰箱中取出，倒掉孔中的液体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，以去除未被吸附的抗原。
四、加入待测样品将待测样品加入免疫平板的孔中，与抗原结合。
然后，将免疫平板放置在室温下孵育一段时间，使待测样品中的抗体与抗原结合。
五、孔的处理将免疫平板从孵育箱中取出，倒掉孔中的液体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，以去除未结合的抗体。
六、加入酶标记抗体将酶标记抗体加入免疫平板的孔中，与待测样品中的抗原结合。
然后，将免疫平板放置在室温下孵育一段时间，使酶标记抗体与待测样品中的抗原结合。
七、孔的处理将免疫平板从孵育箱中取出，倒掉孔中的液体，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，以去除未结合的酶标记抗体。
八、加入底物将底物加入免疫平板的孔中，与酶标记抗体结合。
底物与酶标记抗体结合后产生颜色反应，这个颜色反应的强度与待测样品中的抗原浓度成正比。
九、停止反应通过加入停止溶液，停止底物与酶标记物的反应。
停止溶液会改变底物的颜色，使其停止变化。
十、测定结果将免疫平板放入酶标仪中进行测定，测定底物的吸光度。
通过比较吸光度值，可以对待测样品中的抗原浓度进行定量分析。
酶联免疫吸附测定法的基本步骤如上所述。
它的优点是灵敏度高、特异性强、重复性好，可以用来检测各种类型的抗原和抗体。
因此，酶联免疫吸附测定法在医学、生物学和疾病诊断等领域具有广泛的应用前景。
简述酶联免疫吸附测定的原理
简述酶联免疫吸附测定的原理酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感、高通量的免疫技术，常用于检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
ELISA的原理基于抗体与抗原之间高度特异性的结合，以及酶底物反应的可见色素反应。
ELISA的基本原理如下：1. 酶联：先将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板）上。
最常用的固相载体是聚丙烯酸酯（polystyrene），可以牢固地吸附抗原或抗体。
2.结合：在固相载体上固定的抗原与样品中的分子结合，以形成特异性的抗原-抗体复合物。
3.洗涤：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反复的洗涤步骤。
4.检测：加入与目标分子相关的抗体，这些抗体经过标记，通常是酶标记。
这些标记的抗体与复合物中的目标分子结合。
5.洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除非特异性结合的物质。
6.底物-酶反应：加入合适的底物，底物与酶标记的抗体发生反应，并产生可见的色素物质。
7.读数：用光度计测量反应物的吸光度，吸光度的强度与样品中目标物的浓度成正比。
ELISA的优点是具有高度的特异性和敏感性，可以检测极低浓度的物质。
此外，ELISA还可以同时检测多个样品，并且操作相对简单，不需要昂贵的设备。
ELISA的应用广泛，特别是在医学诊断领域。
例如，ELISA可以用来检测一些疾病的标志物，如乳腺癌、艾滋病、流感等。
此外，ELISA还用于酶抗体检测、药物监测、细菌和病毒的检测等领域。
虽然ELISA是一种非常有用的技术，但也存在一些局限性。
ELISA对样品中的杂质比较敏感，可能会导致假阳性结果。
此外，ELISA只能检测已知的抗原或抗体，无法发现新的目标分子。
此外，ELISA需要时间较长（通常需要2-4小时）。
综上所述，酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种重要的免疫技术，通过抗原与抗体的特异结合和酶底物反应，可以准确、敏感地检测微量生物分子或抗体的存在与浓度。
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3.抗原或抗体的酶标记
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间接ELISA
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸
稀释液
A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 稀释液
S1 一 抗 原 液
顺序(每孔 100ul)
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A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 稀释液
2-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入100uL一抗， 再加100uL一抗到２号孔中，混匀，从２号孔吸取 100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸 取１００uL，丢弃！
环境卫生
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酶催化底物液显色
DH2+ H2O2
E
D+ 2H2O
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。
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酶 /E
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
病原微生物及其抗体检测如:肝炎病 毒,SARS等
蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿 瘤标记物
非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定
……
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ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
科研服务
……
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需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELISA在临床中的广泛应用
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结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅
待检样品孔显色明显 空白对照
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注意事项
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）
倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高 浓度方向进行
终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色 黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色
测定波长
nm
492 450 449 425 642 400 500 405 420 360,450 420
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碱性磷酸酯酶 (AP) 葡萄糖氧化酶
(GOD)
β-Ｄ－半乳糖苷 酶 (β-Gal)
洗涤：3次， 1min/次
E
E
→
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
→
终止液终止显色
加酶标抗体：1:5000稀释 的HRP标记的驴抗兔IgG抗 血清， 37 ℃ ２0min
加底物液显色
每孔加１００ul!
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一 抗 试 管
倍比稀释法与加样
S
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。 根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长
（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。
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免 疫 荧 光 技 术 用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
课程内容
ELISA的原理
ELISA的分类
间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例
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ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化
ห้องสมุดไป่ตู้
鼠IgG(抗原)
免疫 兔抗小鼠IgG(一抗) Fc段 HRP-驴抗兔IgG(二抗)
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操作步骤
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 加待检抗体：倍比稀释的兔 37 ℃ 20min 抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
辣根过氧化物酶 (HRP)
底 物/DH2
邻苯二胺(OPD) 四甲替联苯胺(TMB) 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和 制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
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（四）竞争法（HBcAb ）
HBcAb HBcAg 酶标HBcAb
TMB wash wash
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb， HBcAb； 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不 能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药 物等ELISA测定多用此法。
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其优点在于只要 变换包被抗原就可 利用同一酶标抗抗 体建立检测相应抗 体的方法。可用于 传染病的诊断。
一抗
Ag
酶标二抗
BSA wash wash wash
TMB
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（三）双抗体夹心法（测抗原）
包被Ab
Ag
酶标Ab TMB
wash
wash
wash
酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
免疫学教研室
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体 反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
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免 疫 荧 光 技 术
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ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
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（二）间接法（测抗体）
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗 体以检测已与固相 结合的受检抗体， 故称为间接法。