酶联免疫吸附实验
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附试验
这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化 合物中测定某一特定物质，而不需要先分离待测物。
2，敏感性
在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法 的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感 度约为5~10 μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和 浊度法的敏感度与酶反应相仿。 而酶标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍， 达ng/ml水平。
聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作 工艺的差别，各种产品的质量差异很大， 因此，每一批号的ELISA板在使用前须事 先检查其性能。
常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为 10ng/ml） 包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人 IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测 每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8 左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均 数之差，应小于10%。
这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量， 而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然 后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
生物素-亲和素酶联吸附试验（BA-ELISA）： 待检抗原与固相抗体反应后，再加入生物素化 第二抗体，形成抗原-抗体-生物素化第二抗体复 合物，然后与酶标亲和素作用，并通过底物而 显色。
解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲 和层析法来提纯抗体或抗原（亲和层析纯抗体）。
最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体 复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最 合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗 体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。
特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇 与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构 和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有 高度的特异性。
酶联免疫吸附试验结果
酶联免疫吸附试验结果酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA），是一种广泛应用于生命科学中的试验技术，主要用于检测生物体内特定蛋白质和抗体的存在和数量。
本文将根据不同类别，介绍ELISA试验结果的分析。
一、直接ELISA试验结果分析直接ELISA试验是指将已知抗原沉淀于微孔板上，再加入待检测物，之后加入特定抗体进行检测的试验方法。
当待检测物含有对应的抗原，则抗原和特定抗体结合，形成固定的复合物。
此时，待检测物在微孔板中残留，被进一步检测。
如果待检测物中含有特定抗体，则会与预先添加的抗原结合。
根据特定抗体标记的物质进行检测。
直接ELISA试验结果为同轴柱，并且呈现梯度性图谱。
二、间接ELISA试验结果分析间接ELISA试验是指使用抗原沉淀于微孔板上，加入待检测物，并再次加入特定抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，患者血清或其他样品中含有抗体，抗体与固定的抗原结合，形成复合物。
之后添加特定抗体，间接ELISA试验的结果为同轴柱，并且呈现梯度性的图谱。
三、竞争ELISA试验结果分析竞争ELISA试验是对样品中的特定物质进行检测的试验方法。
在试管中，抗体与已知抗原结合后，特定抗体标记的物质被加入竞争ELISA反应体系中。
如果合适的特定抗体分子与抗原分子竞争结合，则可抑制特定抗体分子与标记物结合，标记物的含量随之减少。
竞争ELISA试验结果为逆向梯度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
四、间接竞争ELISA试验结果分析间接竞争ELISA试验是对患者中特定物质的抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，已知抗原沉淀于微孔板上，加入患者样品，之后加入特定抗体。
如果患者样品中含有特定抗体，将与特定抗体竞争结合，导致标记物与它竞争结合量的减少。
间接竞争ELISA试验结果为逆向梯度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
总之，酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于特异性分子识别原理的分析方法，具有操作简单、稳定可靠、敏感度高等特点。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
讨论报告：酶联免疫吸附试验（ELISA ）一．简介 1.定义：指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
2.基本原理：（1）抗原或抗体的固相化（2）抗原或抗体的酶标记（3）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
大致流程：3.测定类型3.1酶联免疫吸附试验在酶免疫技术中所处的位置这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ），简称ELISA 。
3.2 ELISA 实际是一种抗原抗体反应和酶催化反应具有以下性质：3.2.1 可逆性3.2.2 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
因此测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
3.2.3 存在最适比例酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定可用左图表示，即抗原抗体比例高于或低于某一特定适宜值，二者结合效果都会降低。
3.2.4 敏感性高 由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
3.3 ELISA 的主要测定方法ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体，各种那个测定方法中均有三个必要试剂：（1）故乡的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（2）酶标记的抗原或抗体，称“结合物”（3）酶反应的底物3.3.1双抗体夹心法3.3.1.1双抗体夹心法测抗原3.3.1.2双抗体夹心法测抗体3.3.2 间接法测抗体3.3.3 竞争法3.3.3.1竞争法测抗体此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg 、AFP 等。
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
步骤如图： 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。
酶联免疫吸附试验目的
酶联免疫吸附试验目的酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的免疫学实验方法，主要用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
本文将从ELISA的原理、方法、应用和优势等方面进行详细介绍。
一、ELISA的原理ELISA是一种依赖于酶的信号放大系统来检测抗原或抗体的方法。
其基本原理是将待检测的抗原或抗体与特异性的抗体或抗原结合，再通过酶标记的二抗或二抗体结合体进行信号放大，最后通过酶的底物反应测定酶的活性或产物的浓度，从而间接测定待检测物的存在和浓度。
二、ELISA的方法ELISA方法主要包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等。
其中，直接ELISA是将待检测的抗原或抗体直接与酶标记的二抗或二抗体结合体结合，通过酶的底物反应进行测定；间接ELISA是在待检测的抗原或抗体与特异性的抗体或抗原结合后，再加入酶标记的二抗或二抗体结合体进行信号放大；竞争ELISA是通过待检测的抗原或抗体与特异性的酶标记抗原或抗体竞争结合来测定待检测物的存在和浓度；间接竞争ELISA是将待检测的抗原或抗体与特异性的抗体或抗原结合后，再加入酶标记的竞争抗体或抗原进行信号放大。
三、ELISA的应用ELISA广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物研发等领域。
在生物医学研究中，ELISA可用于检测病原微生物、肿瘤标志物、生物大分子等；在临床诊断中，ELISA可用于病毒感染、自身免疫性疾病、肿瘤标志物检测等；在药物研发中，ELISA可用于药物代谢动力学、药物药效学研究等。
四、ELISA的优势ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便、结果可定量等优点。
通过选择合适的抗原或抗体对，ELISA可以实现对待检测物的高度特异性检测。
另外，ELISA还可以通过标准曲线法进行定量分析，提供待检测物的浓度信息。
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种重要的实验方法，可用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告酶联免疫吸附试验实验报告酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和定量分析抗原或抗体的存在与浓度。
本实验旨在通过ELISA技术，检测和定量分析一种特定抗原在不同样本中的浓度变化。
实验材料和方法：1. 样本制备：收集不同来源的样本，如血清、尿液等，并进行离心分离获得上清液。
2. 酶标板涂覆：将待测抗原溶液加入酶标板孔中，保持一定的温度和时间，使抗原均匀地附着在酶标板表面。
3. 阻断：加入阻断液，封闭未被抗原占据的酶标板孔，避免非特异性结合。
4. 抗体结合：加入特异性抗体，与抗原结合形成抗原-抗体复合物。
5. 酶标记抗体结合：加入酶标记抗体，与抗原-抗体复合物结合，形成二抗夹心复合物。
6. 显色反应：加入底物，使酶标记抗体催化底物发生颜色变化。
7. 反应停止：加入停止液，终止显色反应。
8. 测定吸光度：使用酶标仪测定酶标板孔中的吸光度。
实验结果：根据测定吸光度值，我们可以得到不同样本中抗原的浓度变化。
通过比较不同样本的吸光度值，可以了解抗原在不同条件下的表达情况以及不同样本中抗原的相对浓度。
实验讨论：ELISA技术在生物医学领域具有广泛的应用，尤其在疾病诊断和药物研发方面起到了重要的作用。
通过ELISA技术，可以检测和定量分析目标抗原的存在与浓度，从而判断疾病的发生与发展，为临床诊断提供依据。
在本次实验中，我们选择了特定抗原作为目标，通过ELISA技术对其进行检测和定量分析。
实验结果显示，不同样本中抗原的浓度存在差异，这可能与样本来源、处理方法等因素有关。
通过进一步的研究和分析，可以进一步探究这些差异的原因，并为临床诊断和治疗提供更准确的依据。
此外，ELISA技术还可以用于药物研发过程中的药物筛选和药效评价。
通过检测药物对特定抗原的影响，可以评估药物的疗效和安全性，为新药的研发提供重要的参考依据。
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法标准一、概述酶联免疫吸附法是一种常用的生物检测方法，用于测定抗原或抗体。
该方法具有高灵敏度、特异性和准确性等特点，广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测等领域。
本文将介绍酶联免疫吸附法的原理、试剂和操作步骤等标准要求。
二、原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是基于抗原抗体反应的检测方法。
在固相载体上标记特异性抗原或抗体，与样品中的靶分子结合后，再加入酶标记的抗靶分子抗体，最后通过底物显色反应观察结果。
根据颜色深浅程度可以判断样本中靶分子的浓度。
三、试剂1. 特异性抗原或抗体的纯化溶液：需经过质量控制，确保其准确性和特异性。
2. 酶标抗体的纯化溶液：应选择合适的酶标记抗体，以增强颜色反应的敏感性。
3. 洗涤液：用于去除实验过程中产生的非特异性结合物质。
4. 底物及终止液：用于颜色反应，可根据需要配置不同颜色的底物和终止液。
5. 其他所需辅助试剂：如缓冲液、防腐剂等。
四、操作步骤1. 准备试剂和设备：按照试剂说明书准备好所有试剂和设备，并确保仪器正常运行。
2. 包被抗原或抗体：将特异性抗原或抗体包被在固相载体上，制备成酶标板。
3. 加样：分别加入待测样品、标准品和阴性对照品，每个样品需设复孔。
4. 温育：将酶标板放置在恒温水浴中保温一定时间，使抗原抗体反应充分进行。
5. 洗涤：用洗涤液清洗酶标板表面，去除非特异性结合物质。
6. 添加底物：加入酶标抗体，继续温育并洗涤。
7. 显色反应：加入底物溶液，观察并记录颜色变化。
8. 终止反应：加入终止液，停止显色反应。
9. 检测与分析：用酶标仪测量各孔的光密度值，根据标准曲线的绘制得出待测样品中靶分子的浓度。
五、注意事项1. 应严格控制试剂和样本的质量，确保实验结果的准确性。
2. 在操作过程中应注意无菌操作，避免污染。
3. 洗涤时应彻底，以免影响实验结果。
4. 注意观察显色反应的时间和颜色深度，以确保实验过程的顺利进行。
5. 对于特殊样本（如血浆、组织匀浆液等），应在实验前进行处理，以保证实验结果的可靠性。
酶联免疫吸附实验
酶联免疫吸附实验一、实验目的1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。
2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。
3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛的杂交瘤细胞株。
4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。
二、实验原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。
这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。
在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。
三、实验试剂与器材1、实验试剂在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M BOTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司；碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司；羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司；实验用水为重蒸去离子水2、实验器材U-3000紫外扫描仪日本岛津公司；550 型酶标仪美国Bio-Rad 公司；HI9321酸度计美国Hanna 公司；AE260 电子天平德国Mettler公司；DK-8D电热恒温水槽上海一恒科技有限公司；2-93自动双重纯水蒸馏器、93-3定时恒温双向磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂；1201 超净工作台美国Forma Scientific公司；DMI3000B倒置生物显微镜德国Leica 公司；GS-15R多功能冷冻离心机美国Beckmen公司；3701型CO2培养箱美国Precision 公司；96孔、24 孔细胞培养板美国Costar 公司；96孔酶标板浙江玉环芦蒲塑化器械厂。
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ELISA酶联免疫吸附试验在动物生产过程中的
应用
简介
随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，大大提高了ELISA的特异性，由于电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。
在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。
基本原理
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
特性
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
如今应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
辣根过氧化物酶
过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH 值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。
RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。
RZ在2.5以上者方可用于标记。
HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，
但反应快，颜色明显。
碱性磷酸酶
系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。
它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。
酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。
酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。
标记方法
良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。
抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。
在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。
郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。
其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟，取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含
5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许。