酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项

（2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温 度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一 种则为43℃下45分钟。从免疫测定抗原抗体反 应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时 间最为完全，产物最稳定。如2－8℃下反应24 小时。较高的反应温度，由于分子运动的加快， 反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳 性样本测定没有问题，但对分子含量少的弱阳 性样本则有漏检的可能。因此，如须选择反应 条件，建议在临床ELISA测定中尽量使用较低 温度较长反应时间的条件。

而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着 水面，可使温度迅速平衡。让反应板飘浮在水面 上。就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可 提高测定的重复性。



洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但也决定着实 验的成败。ELISA就是靠洗涤清除残留在板孔中没 能与固相抗体（抗原）结合的物质，以及在反应过 程中非特异性的吸附于固相载体的干扰物质，以保 证ELISA测定的特异性。 洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯 载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂 既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水 溶液状态，从而脱离固相载体。 在实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式， 即手工和洗板机洗板。为保证微孔板的均一性使结 果准确可靠，最好选用洗板机洗板。若手工洗板， 要注意浸泡时间和孔间洗液最好不要互相流动。流 水冲洗法让水流冲击板孔表面，简便、快速，洗涤 效果较好。
3 加样本及反应试剂
4 温育



温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个 因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中的抗原或抗 体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在 一定温度条件下反应一定的时间。一般温育所需时 间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。 最为常用的温度有37℃和室温(20－25℃)，其次是 43℃和2－8℃，目前国内ELISA商品试剂盒的反应 温育时间通常为37℃30－60分钟。 关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：



（1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。 一般来说，加完样本或反应试剂后，将微孔板从室 温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至 37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及 非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而 在临床实验中，很少有人注意这个问题，通常是将 微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成 在实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来 的问题。 为保证37℃下足够的温育时间，实验室水浴状态应 保证微孔板底贴着水面，使温度迅速平衡。为避免 蒸发，板上应贴片或封盖。
ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例）
•ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶 催化底物显色来判断结果。

影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集 保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控 制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等 一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确 性和可靠性。
因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、 板孔内标本的非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘 等对特异显色干扰的优点。

8 结果判断

临床ELISA测定按其表示测定结果的方式 分为定性和定量测定两大类。 定性测定只是对标本中是否含有待测抗原 或抗体作出“有”或“无”的结论，分别 用“阳性”和“阴性”来表示；定量测定， 每批测试均须用一系列不同浓度的标准品 在相同的条件下制作标准曲线。

7 比色

ELISA的比色测定由酶标仪进行。此处强调以下几 点： （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜 在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读 结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细 阅读说明书。 （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液 体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪 比色架。 （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已 调至合适或所用滤光片是否正确。
2 试剂的准备

（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出， 在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使 试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的， 主要是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度 能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。 （2）试剂盒中的洗涤液如需在使用时对所提供 的浓缩液稀释配制，稀释时所用的蒸馏水或去 离子水应保证质量。


（3）“边缘效应”的排除。 以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有 “边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。聚苯 乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA 测定中，将板从室温置于37℃温箱(非水浴)，板 孔升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热 力学梯度。因此反应板不宜叠放，以保证各板的 温度都能迅速平衡。
移液枪的养护及注意事项




吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突 然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造 成漏气。 移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放 或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强酸、强碱等。 如有液体进入枪体，应及时擦干。 千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置 而损坏移液枪。 移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹 簧恢复原形，保持松弛状态，延长移液枪的使用寿命。 应定期对移液枪进行校准。


1 标本的收集和保存

（1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性， 因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的 ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓 度较高，则其很容易在温育过程中吸附于固相， 从而与后面加入的底物反应，从而产生非特异性 显色。

2 试剂的准备
试剂盒成分： 常用的固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、 聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高， 空白值底，各板之间、同一板各孔之间性能相近。 包被抗原或抗体与聚苯乙烯固相载体通过疏水基团 作用物理吸附结合。 常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖 苷酶和脲酶等。 洗液：非离子型洗涤剂 酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和 ABTS，为供氢体。 终止液为硫酸。





在ELISA实验中一般有3次加样步骤，即加标本、加 酶结合物、加底物和显色剂。 加样必须注意的关键点是： （1）加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅 出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有 效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。 （2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。 有些测定需用稀释的血清，应保证稀释液与血清混 合均匀。 （3）加酶结合物、加底物，应使加液量准确均一、 加液过程迅速完成。也可使用试剂盒提供的滴瓶直 接滴加。滴加时，除了要注意滴加的角度垂直、一 致外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出 现重复滴加或加在两孔之间的现象。


（1） 垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液 面2-4mm以下。 （2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸 嘴内壁液体吸附达到饱和，再吸入样液， 最后打出液体的体积会很精确。
一般液体，正向吸液（一档二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。

正向吸液
反向吸液

（3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速 度。吸液速度太快会产生反冲和气泡， 导致移液体积不准确和腐蚀枪体。 （4） 吸取后将移液枪提离液面，停约 一秒钟，观察是否有液滴缓慢地流出。 若有流出，说明有漏气现象（原因有： 枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部 气密性不好）。 （5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或 用滤纸蘸擦。
一、移液枪的使用
1. 样品准备
（1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相 同温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温 放置，使温度平衡后再吸样。 液体温度 > 吸头温度的 移取的液体体积会 偏大 液体温度 < 吸头温度的 移取的液体体积会 偏小 （2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便 吸取。
酶联免疫吸附试验手工操作注 意事项
酶免疫测定类型
酶免疫组化 酶免疫技术 酶免疫测定 均相酶免疫测定 固相酶免疫测定
非均相酶免疫测定
液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为 酶联免bent Assay），简称ELISA。
二、ELISA具体操作


1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断
1 标本的收集和保存

未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用 木棍等剥离凝血块。通常于室温（20－25℃）放 置30－60min，血标本可自发完全凝集，析出血 清；或37℃水浴20－30min，析出血清。 以3000r/min转速离心5－10min，使血清分离完 全。 若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维 蛋白原，吸附于反应微孔，并且不易洗去，可与 酶标记物非特异性结合，造成假阳性。
5 洗板
6 显色

在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，一 般显色反应条件为37℃或室温反应15－30 分钟。在一定时间内，阴性孔可保持无色， 而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。TMB （四甲基联苯胺）经HRP作用后，约40分 钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后 可完全消退至无色。 TMB的终止液有多种，酸性终止液（硫酸） 会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长 （450nm）测读吸光值。
2. 体积设定

大体积 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调 可保证最佳的精确度