酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测目标蛋白或抗原的存在与浓度，以及对特定抗体的识别和结合情况。
通过本实验，我们可以了解到酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，以及在生物医学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理。
酶联免疫吸附试验是一种利用酶和抗体的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
其原理是将待检测的抗原或抗体吸附在微孔板表面，然后加入特异性抗体，并通过酶标记的二抗或底物来检测特异性结合的信号。
当待测物与特异性抗体结合后，通过底物的酶反应产生可定量的颜色反应，从而测定待测物的浓度。
三、实验材料和方法。
1. 实验材料，微孔板、待测抗原或抗体、特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
2. 实验步骤，将待测抗原或抗体加入微孔板孔中，加入特异性抗体，洗涤孔板，加入酶标记的二抗，再次洗涤孔板，加入底物溶液，停止反应，测定吸光度。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功检测出待测物的存在与浓度，并观察到特异性抗体与待测物的结合情况。
根据实验结果，我们可以得出待测物的浓度，并进一步分析其在生物学过程中的作用和意义。
五、实验结论。
酶联免疫吸附试验是一种高度敏感和特异性的实验方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
通过本次实验，我们深入了解了酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，掌握了实验技术和数据分析方法，为今后的科研工作和临床诊断提供了重要的参考和支持。
六、实验展望。
酶联免疫吸附试验作为一种重要的生物学实验方法，具有广阔的应用前景。
今后，我们将进一步深入研究酶联免疫吸附试验的原理和技术，开展更多的实验和应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的支持和帮助。
七、参考文献。
1. Smith, J. et al. (2010). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol, 588, 89-94.2. Green, N. M. (2015). Avidin and streptavidin. Methods Enzymol, 184, 51-67.以上就是本次酶联免疫吸附试验的实验报告，谢谢阅读。
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（ELISA）——直接法一、原理酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。
其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关。
在本实验中，以辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体，与相应抗原IgG结合，标记的酶可催化底物（邻苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
二、材料：1. 人IgG包被的微量酶标反应板（1：1万，1：10万，1：40万，1：80万，1：100万），2. 酶标抗人IgG抗体稀释液、洗涤液（PH7.4，0.01M PBS-Tween20）、底物溶液，3. 微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37℃恒温箱等。
三、方法：1. 人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入第1至5孔，设第6孔为对照。
置37℃恒温箱2小时，取出，移入4℃冰箱过夜。
取出，用洗涤液洗3次，3分钟/次（略）。
2. 用含小牛血清（BSA）的PH7.4 PBS封闭，置37℃恒温箱，30分钟，取出。
用洗涤液洗3次，3分钟/次（略）。
3.用微量移液器吸取100ul酶标抗人IgG抗体，分别加入第6至1孔。
置湿盒中，于37℃恒温箱中孵育30分钟。
4. 取出酶标板，用洗涤液洗3次，3分钟/次。
5. 按第6孔至第1孔的顺序，每孔各加100ul的底物溶液，置37℃恒温箱中10-15分钟。
6. 观察显色反应。
四、结果五、结论。
酶联免疫吸附试验
这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化 合物中测定某一特定物质，而不需要先分离待测物。
2，敏感性
在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法 的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感 度约为5~10 μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和 浊度法的敏感度与酶反应相仿。 而酶标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍， 达ng/ml水平。
聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作 工艺的差别，各种产品的质量差异很大， 因此，每一批号的ELISA板在使用前须事 先检查其性能。
常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为 10ng/ml） 包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人 IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测 每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8 左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均 数之差，应小于10%。
这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量， 而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然 后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
生物素-亲和素酶联吸附试验（BA-ELISA）： 待检抗原与固相抗体反应后，再加入生物素化 第二抗体，形成抗原-抗体-生物素化第二抗体复 合物，然后与酶标亲和素作用，并通过底物而 显色。
解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲 和层析法来提纯抗体或抗原（亲和层析纯抗体）。
最适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体 复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最 合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗 体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。
特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇 与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构 和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有 高度的特异性。
酶联免疫吸附实验 (ELISA)
酶联免疫吸附实验(ELISA)1.实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
2.实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－D－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶催化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
讨论报告：酶联免疫吸附试验（ELISA ）一．简介 1.定义：指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
2.基本原理：（1）抗原或抗体的固相化（2）抗原或抗体的酶标记（3）加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。
大致流程：3.测定类型3.1酶联免疫吸附试验在酶免疫技术中所处的位置这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ），简称ELISA 。
3.2 ELISA 实际是一种抗原抗体反应和酶催化反应具有以下性质：3.2.1 可逆性3.2.2 特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。
化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。
因此测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。
3.2.3 存在最适比例酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定可用左图表示，即抗原抗体比例高于或低于某一特定适宜值，二者结合效果都会降低。
3.2.4 敏感性高 由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
3.3 ELISA 的主要测定方法ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体，各种那个测定方法中均有三个必要试剂：（1）故乡的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（2）酶标记的抗原或抗体，称“结合物”（3）酶反应的底物3.3.1双抗体夹心法3.3.1.1双抗体夹心法测抗原3.3.1.2双抗体夹心法测抗体3.3.2 间接法测抗体3.3.3 竞争法3.3.3.1竞争法测抗体此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg 、AFP 等。
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
步骤如图： 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。
酶联免疫吸附实验
酶联免疫吸附实验一、实验目的1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。
2、采用间接ELISA 法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。
3、用间接ELISA 和间接竞争ELISA 筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛的杂交瘤细胞株。
4、采用间接ELISA 法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗体敏感性，采用间接ELISA 检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。
二、实验原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。
这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。
在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。
三、实验试剂与器材1、实验试剂在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mL OTA-OV A；标记物是1:1000 倍用含5% 猪血清的PBST 稀释的50μL/ 孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/ 孔的T M BOTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OV A)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司；碳化二亚胺(EDC)英国Thermo Scientific 公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司；羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司；实验用水为重蒸去离子水2、实验器材U-3000紫外扫描仪日本岛津公司；550 型酶标仪美国Bio-Rad 公司；HI9321酸度计美国Hanna 公司；AE260 电子天平德国Mettler公司；DK-8D电热恒温水槽上海一恒科技有限公司；2-93自动双重纯水蒸馏器、93-3定时恒温双向磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂；1201 超净工作台美国Forma Scientific公司；DMI3000B倒置生物显微镜德国Leica 公司；GS-15R多功能冷冻离心机美国Beckmen公司；3701型CO2培养箱美国Precision 公司；96孔、24 孔细胞培养板美国Costar 公司；96孔酶标板浙江玉环芦蒲塑化器械厂。
酶联免疫吸附试验
技术创新：新型的酶联免疫吸附试验技术不断涌现如荧光标记技术、量子点标记技术等提高了检测的灵敏度和特异性。
市场需求：随着生物技术的不断发展酶联免疫吸附试验在临床诊断、食品安全、生物医药等领域的需求不断增长。
发展趋势：随着检测技术的不断进步酶联免疫吸附试验将朝着更快速、更准确、更自动化的方向发展。
应用领域拓展：酶联免疫吸附试验的应用领域不断拓展如肿瘤标志物检测、病毒检测、食品安全检测等为各领域的发展提供了有力支持。
荧光标记技术：提高灵敏度降低背景干扰
磁珠分离技术：快速分离抗原抗体提高试验速度
酶联免疫吸附试验在交叉学科领域的应用前景
酶联免疫吸附试验在生物医学领域的应用
酶联免疫吸附试验在环境监测领域的应用
酶联免疫吸附试验在农业科技领域的应用
酶联免疫吸附试验在食品安全检测领域的应用
酶联免疫吸附试验的市场需求与发展趋势
联合检测：将酶联免疫吸附试验与其他检测方法相结合提高检测的灵敏度和特异性。
标准化和规范化：建立酶联免疫吸附试验的标准化和规范化操作流程确保试验结果的准确性和可靠性。
酶联免疫吸附试验的发展趋势
PRT SIX
酶联免疫吸附试验的技术创新与突破
自动化技术：提高试验效率降低人为误差
微孔板技术：简化操作减少样本用量
PRT TWO
酶联免疫吸附试验的定义
酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫分析技术
通过酶与抗体或抗原的结合实现对目标分子的定量或定性检测
酶可以放大信号提高检测的灵敏度和特异性
酶联免疫吸附试验广泛应用于生物学、医学等领域
酶联免疫吸附试验的原理
洗涤去除未结合的成分后加入底物显色通过颜色反应判断待测物的浓度。
阻断酶联免疫吸附试验：将抗体先固定在固相载体上再用酶标记的抗原进行检测最后加入底物显色。
免疫酶联免疫吸附实验报告
免疫酶联免疫吸附实验报告一、引言免疫酶联免疫吸附实验（ELISA），是一种常用于检测抗原或抗体的方法。
该实验利用酶的特异性反应来定量或定性测定目标物在样品中的存在量。
本实验旨在通过免疫酶联免疫吸附实验检测目标抗原的存在。
二、实验材料和方法 1. 实验材料 - ELISA板：含有特异性抗体的孔板 - 样品：待测的抗原溶液 - 阻断缓冲液：用于防止非特异性结合 - 洗涤缓冲液：用于洗涤ELISA板 - 特异性抗原抗体：用于与目标抗原结合 - 辣根过氧化物酶标记的二抗：与特异性抗原抗体结合 - 底物溶液：用于酶的反应产生可测量的产物2.实验方法•准备ELISA板：加入特异性抗体溶液并孵育，以使其在孔板上固定•添加阻断缓冲液：加入阻断缓冲液，以防止非特异性结合•加入样品：将待测样品加入孔板，并孵育使其与特异性抗体结合•洗涤：用洗涤缓冲液洗涤孔板，以去除未结合的物质•添加辣根过氧化物酶标记的二抗：加入与特异性抗原抗体结合的辣根过氧化物酶标记的二抗，使其与目标抗原结合•洗涤：用洗涤缓冲液洗涤孔板，以去除未结合的物质•加入底物溶液：加入底物溶液，并孵育使酶反应发生•反应停止：加入反应停止液，以停止酶反应•测量吸光度：使用ELISA阅读器测量吸光度，得到结果三、实验结果与讨论本实验使用ELISA方法成功检测到了目标抗原的存在。
在测量吸光度的过程中，我们发现样品中目标抗原与特异性抗体发生特异性结合，而其他非特异性的物质则被洗涤缓冲液去除。
根据实验结果，我们可以通过吸光度的数值判断样品中目标抗原的含量或存在与否。
通常情况下，吸光度数值越高，说明目标抗原的含量越高。
需要注意的是，在进行ELISA实验时，实验操作的准确性和仪器的稳定性对结果的准确性有重要影响。
因此，在实验过程中，我们应严格控制实验条件，并对仪器进行校准。
四、实验结论免疫酶联免疫吸附实验是一种有效的检测目标抗原的方法。
通过特异性抗体与待测样品中的目标抗原结合，再通过酶的特异性反应，我们可以通过测量吸光度来判断目标抗原的存在与否。
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实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、实验目的
了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。
二、实验原理
将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。
常用酶及底物
常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ>3.1
碱性磷酸酶（AP）
邻苯二胺（OPD）
四甲基联苯胺（TMB）
对硝基苯磷酸酯（p-NPP）
橙黄色
蓝色
黄色
棕黄色
黄色
黄色
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
常用的三种类型：
1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。
它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）
双抗体夹心法用于检测抗原。
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。
操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。
底物的降解量＝抗原量。
3、竞争ELISA
竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。
它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。
三、主要仪器及试材
以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。
使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。
本试剂盒含:
1、包被抗原的微孔板；
2、阴、阳性对照血清；
3、抗猪IgG-HRP结合物；
4、洗涤液；
5、底物A液、B液；
6、终止液；
7、样品稀释液
本实验所需仪器和试剂：
1、酶联免疫测定仪
2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白）
3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清
4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP
5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO
3，2.93g NaHCO
3
，加
ddH
2
O至1000mL
6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g
Na
2HPO
4
·12H
2
O，0.2g KH
2
PO
4
，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH
2
O至1000mL。
7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL
8、底物液（TMB-H2O2）：
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na
2HPO
4
，24.3mL 0.1mol/L 柠
檬酸液，加50mL ddH
2
O。
TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。
底物液（TMB）：新鲜配制。
TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物
液加入0.2μL 30% H
2O
2。
9、终止液：0.25% 氢氟酸
四、实验方法与步骤
（一）试剂配制
1、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO
3，2.93g NaHCO
3
，加
ddH
2
O至1000mL
2、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4）：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g
Na
2HPO
4
·12H
2
O，0.2g KH
2
PO
4
，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH
2
O至1000mL。
3、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL。
4、底物液（TMB-H2O2）：
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na
2
HPO
4
，24.3mL 0.1mol/L 柠
檬酸液，加50mL ddH
2
O。
TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。
底物液（TMB）：新鲜配制。
TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物
液加入0.2μL 30% H
2O
2。
5、终止液：0.25% 氢氟酸
（二）实验步骤
1、取已包被伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检样品1∶40稀释后加入板孔中，每孔加100μl。
同样1∶40稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设2孔，每孔100μl。
另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl 稀释液（PBS）。
轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育20－30分钟。
2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，每次2－3分钟，200μl/孔，每次在干净吸水纸上拍干。
3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育20－30分钟。
4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。
5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。
室温避光显色，10分钟
后，每孔加终止液（0.25% 氢氟酸）1滴(50μl)，终止反应。
6、15分钟内测定结果。
采用波长630nm的酶标仪测定OD值。
检测样本的OD值≥0.4为阳性。
五、实验注意事项
1、实验前血清样品必须置37℃灭活30分钟。
2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。
洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低非特异吸附的作用。
洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。
3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。
六、实验结果处理
以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD
630值。
试验成立的条件是阳性对照孔平均OD
630
值
大于或等于1.0，阴性对照孔平均OD630值必须小于0.2。
样品OD
630
值大于0.4，判为阳性；样品OD630值在0.38到0.40之间，判为可疑；样品
OD
630
值小于0.38，判为阴性。
七、思考题
1、间接酶联免疫吸附试验的原理。
2、鉴别诊断基本原理及其意义。
3、间接酶联免疫吸附试验检测的临床意义。