ELISA酶联免疫吸附试验报告
酶联免疫吸附测定实验报告
酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定实验报告酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样本中特定分子的存在。
本实验旨在通过ELISA技术，对特定抗原在样本中的含量进行测定，并了解其原理及应用。
一、实验原理ELISA技术是一种基于免疫反应的实验方法，其原理主要包括固相吸附、特异性结合、酶标记和显色反应。
首先，在微孔板中固定特异性抗体，形成固相吸附。
然后，加入待测样本，样本中的目标抗原与固相抗体结合。
接着，加入酶标记的二抗与目标抗原结合，形成特异性结合。
最后，通过添加显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化，从而定量分析目标抗原的含量。
二、实验步骤1. 准备样本和试剂：收集待测样本，如血清、尿液或细胞培养上清液，并准备好ELISA试剂盒中的各种试剂。
2. 板洗涤：将微孔板放入洗板机中，加入洗板缓冲液，进行洗涤步骤，以去除未结合的物质。
3. 固相吸附：将特异性抗体加入微孔板孔中，孵育一段时间，使其与固相吸附。
4. 样本孵育：将待测样本加入各孔中，与固相抗体结合，在恒温条件下孵育。
5. 二抗结合：加入酶标记的二抗，与目标抗原结合形成特异性结合。
6. 洗涤：再次进行洗板步骤，去除未结合的物质。
7. 底物反应：加入显色底物，酶催化反应产生可见的颜色变化。
8. 反应终止：加入终止液，停止酶催化反应。
9. 测定吸光度：使用酶标仪测定各孔的吸光度值。
10. 数据分析：根据吸光度值，绘制标准曲线，通过比较待测样本的吸光度值，计算出目标抗原的浓度。
三、实验结果通过ELISA实验，我们成功测定了待测样本中目标抗原的含量。
根据标准曲线，我们计算出了各样本中目标抗原的浓度。
这些结果将有助于我们了解样本中特定分子的水平，从而进一步研究其生物学功能和相关疾病的发生机制。
四、实验应用ELISA技术具有广泛的应用领域，包括生物医学研究、临床诊断、药物开发等。
酶联免疫吸附试验实验报告
酶联免疫吸附试验实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测目标蛋白或抗原的存在与浓度，以及对特定抗体的识别和结合情况。
通过本实验，我们可以了解到酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，以及在生物医学研究和临床诊断中的应用。
二、实验原理。
酶联免疫吸附试验是一种利用酶和抗体的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
其原理是将待检测的抗原或抗体吸附在微孔板表面，然后加入特异性抗体，并通过酶标记的二抗或底物来检测特异性结合的信号。
当待测物与特异性抗体结合后，通过底物的酶反应产生可定量的颜色反应，从而测定待测物的浓度。
三、实验材料和方法。
1. 实验材料，微孔板、待测抗原或抗体、特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
2. 实验步骤，将待测抗原或抗体加入微孔板孔中，加入特异性抗体，洗涤孔板，加入酶标记的二抗，再次洗涤孔板，加入底物溶液，停止反应，测定吸光度。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功检测出待测物的存在与浓度，并观察到特异性抗体与待测物的结合情况。
根据实验结果，我们可以得出待测物的浓度，并进一步分析其在生物学过程中的作用和意义。
五、实验结论。
酶联免疫吸附试验是一种高度敏感和特异性的实验方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。
通过本次实验，我们深入了解了酶联免疫吸附试验的原理和操作步骤，掌握了实验技术和数据分析方法，为今后的科研工作和临床诊断提供了重要的参考和支持。
六、实验展望。
酶联免疫吸附试验作为一种重要的生物学实验方法，具有广阔的应用前景。
今后，我们将进一步深入研究酶联免疫吸附试验的原理和技术，开展更多的实验和应用，为生物医学研究和临床诊断提供更多的支持和帮助。
七、参考文献。
1. Smith, J. et al. (2010). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol, 588, 89-94.2. Green, N. M. (2015). Avidin and streptavidin. Methods Enzymol, 184, 51-67.以上就是本次酶联免疫吸附试验的实验报告，谢谢阅读。
酶联免疫吸附实验报告
酶联免疫吸附实验报告酶联免疫吸附实验报告酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是一种常用的生物化学技术，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在。
该实验结合了免疫学和酶学的原理，通过酶的催化作用来实现对目标物的检测。
本报告将介绍酶联免疫吸附实验的基本原理、操作步骤以及结果分析。
一、实验原理酶联免疫吸附实验的原理基于免疫学的特异性识别和酶学的催化作用。
实验中，首先将待测物（抗原或抗体）与特异性的抗体或抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，将该复合物与与酶标记的抗体或抗原结合，形成二抗或二抗原复合物。
最后，通过添加底物，利用酶的催化作用产生可测量的信号，从而确定待测物的存在或浓度。
二、实验步骤1. 准备样品和试剂：收集待测物样品，并准备所需的试剂，如抗体、底物等。
2. 预处理样品：根据待测物的性质，进行必要的样品预处理，如稀释、去除干扰物等。
3. 涂布固相支持物：将特异性抗体或抗原溶液均匀涂布在固相支持物（如酶标板）上，使其吸附。
4. 孵育：将待测物样品加入酶标板中，与固相支持物上的抗体或抗原结合，形成复合物。
然后加入酶标记的抗体或抗原，形成二抗或二抗原复合物。
孵育一段时间，以便复合物的形成。
5. 洗涤：将酶标板反复洗涤，去除未结合的物质。
6. 底物反应：加入适当的底物，使底物与酶发生反应，产生可测量的信号。
底物的选择与酶的选择有关，常用的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）等。
7. 反应停止：通过添加反应停止剂，停止底物的反应，并使产生的信号停止发展。
8. 读取结果：使用酶标仪或其他适当的仪器，测量底物反应产生的信号的强度。
根据标准曲线或对照样品，确定待测物的浓度或存在与否。
三、结果分析根据实验结果，可以定量测定待测物的浓度或判断其存在与否。
一般来说，酶标仪测得的信号强度与待测物的浓度成正比，可以通过标准曲线来确定待测物的浓度。
elisa实验报告范文
elisa实验报告范文篇一：Elia实验名称：酶联免疫吸附剂测定实验原理：酶联免疫吸附测定是一种免疫测定技术。
测定中，先使抗原吸附在固相载体上，然后加待测的抗体，再用某种酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的“双抗体夹心”，此时酶仍保有活性，同时标记抗体亦有免疫活性。
之后再加入酶的底物，在酶的催化下产生反应并产生有色物，颜色深浅与待测物质的量直接相关。
至此，酶的催化放大作用与免疫反应的特异性相完美结合，提高了测定的准确性与灵敏度。
实验材料与试剂：1．聚苯乙烯微量细胞培养板(平板,96孔)。
2．酶联免疫检测仪。
3．辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
4．包被液：0.05mol/L碳酸缓冲液（pH9.6）：Na2CO30.15g,NaHCO30.293g，蒸馏水稀释至100ml。
5．稀释液（PBS-Tween）：NaCl8g,KCl0.2g，KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,Tween-20，0.5ml，蒸馏水加至1000ml。
6．洗涤液：同稀释液。
7．封闭液：0.5%（质量分数）BSA（用PBS配制）。
8．邻苯二胺溶液(底物)：配制：0.1mol/L柠檬酸(2.1g/100ml),取6.1ml，0.2mol/LNa2HPO4·12H2O(7.163g/100ml),取6.4ml,加蒸馏水12.5ml,取邻苯二胺8mg（溶解）；临用前加30%（体积分数）H2O240μl。
9．终止液：2mol/LH2SO4。
实验步骤：１．包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释,一般为1~10μg/孔，每孔加200μl,37℃温育30min。
２．洗涤：倒尽板孔中液体，加200μl洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
３．加封闭液200μl，37℃温育30min。
４．洗涤同2。
５．加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200μl。
同时作稀释液对照。
37℃温育30min。
elisa酶联免疫吸附实验报告
e l i s a酶联免疫吸附实验报告一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（ＲeinheitZahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ 值要求在3.0以上。
E L I S A的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA(酶联免疫吸附测定)实验报告
ELISALin Chengyu Bio 04 2010030007Experiment Date: 2012-03-12 Submitting Date: 2012-03-211Introduction1.1Background informationELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is a solid-phase assay for antibodiesemploying ligands labeled with enzymes which is widely used for immunological assays.This technique can be applied to detect antigens or antibodies for qualitative orquantitative purpose. Since enzyme reactions are very well known amplificationprocesses, the signal is generated by enzymes which are linked to the detection reagentsin fixed proportions to allow accurate quantification.11.2Major principlesFigure 1 Schematic diagram of ELISA2Figure 2 Procedure of indirect ELISA3As shown in Figure 1 & 2, the general procedure of indirect ELSIA is to: incubate theplate well with antigen, wash off unbounded antigen, incubate with 1st antibody, washoff unbounded 1st antibody, incubate with labeled 2nd antibody, wash off unbounded 2ndantibody, incubate with enzyme substrate solution, and detect optical density or otherindex showing enzyme activity.2Experiment Operation2.1Antigen coating(1)Prepare an antigen solution in coating buffer (human IgG at 0.025mg/ml);(2)Pipette 200 μl antigen solution to each well (Row: B~G; Column: 2~10; Column 11is negative control without antigen) of the microtiter plate;(3)Incubate the plate at 37 ℃for 30 min;(4)Remove the antigen solution;(5)Wash each well with 200 μl with PBS-T for 3 times;(6)Block each well (Row: B~G; Column: 2~11) with 200 μl 0.5% BSA-PBS, andincubate the plate at 37 ℃for 30 min;(7)Remove the blocking solution;(8)Wash each well with 200 μl with PBS-T for 3 times.2.2Primary antibody reaction(1)Dilute the primary antibody (rabbit-anti-human IgG antiserum) in PBS-T fordifferent dilution (from 1:400 to 1:51,200 in 2-folds dilution);(2)Add 200 μl diluted antibody solution to each well following Table 1;Table 1 Scheme to add primary antibody(3)Incubate the plate at 37 ℃for 1 hour;(4)Remove the primary antibody solution;(5)Wash each well with 200 μl PBS-T for 3 times.2.3Application of secondary antibody(1)Dilute the peroxidase conjugated secondary antibody (Goat-anti-rabbit IgG-HRP) inPBS-T at the dilution of 1:20,000 and 1:40,000;(2)Add 200 μl secondary antibody solution to each well following Table 2;(3)Incubate the plate at 37 ℃for 1 hour;(4)Remove the secondary antibody solution;(5)Wash each well with 200 μl PBS-T for 3 times.2.4Substrate development(1)Add 200 μl substrate solution to each well (Row: B~G ,Column: 2~11);(2)Incubate for approximately 3 min;(3)Add 50 μl 2 M H2SO4 to each well to terminate the reaction;(4)Measure optical density at 490 nm.3Raw data and its processing3.1Raw data3.2Data processingSet Row B, C, and D as Group I, and Row E, F, and G as Group II. The processed datais shown in Table 4Table 4 Processed data: optical density of each groupSet different dilutions of primary antibody as x axis, optical density as y axis, drawFigure 3 to illustrate their relation.Figure 3 Relationship between optical density and dilutions of primary antibodyFor the reason that the curve cannot illustrate the relationship enough, change the x axis to nature logarithm of different dilutions of primary antibody. See Figure 4:Figure 4 Relationship between optical density and natural logarithm of dilutions of primary antibodyUsing linear fit for each group, we can figure out that two lines are approximately parallel.In the black curve in Figure 3, there is an oblivious point of inflection which corresponds with the dilution of 1:800. The curve after this point becomes flat, which indicates that the binding between antigens and primary antibodies is saturated in the dilution of 1:800 and higher. This data can suggest that in other immunoenzymatic experiment, the proper dilution of primary antibody will be around, and no higher than 1:800.What’s more, from the red line in Figure 4 we can figure out that the optical density hasa linear relation with natural logarithm of dilutions of the primary antibody.As for comparison between Group I and Group II, from Figure 3 we can figure out thatthe point of infection of blue curve, which corresponds with the dilution of 1:40,000, ison the left, about 1:1600.In Figure 4, the green line (1:40,000) is positioned lower than the red line (1:20,000),which is easy to understand. Lower concentration of secondary antibody means lessbinding with primary antibody during application of secondary antibody.4Results and discussion4.1Results(1)The optical density has an approximately linear relation with the natural logarithmof the dilutions of the primary antibody;(2)For secondary antibody in the dilution of 1:20,000, the proper dilution of primaryantibody is 1:800; for secondary antibody in the dilution of 1:40,000, primaryantibody is recommended to be 1:1600;(3)With the same dilution of antigen and primary antibody, higher concentration ofsecondary antibody will get a higher optical density;4.2Discussion(1)What is the significance of the negative control groups?I.The no primary antibody groups proved that there is no specific bindingbetween antigen and secondary antibody, and provided a background ofnon-specific binding between secondary antibody and antigen;II.The no antigen groups can provide a background of non-specific binding between primary antibody and BSA.(2)Why washing step is essential?Washing each well with PBS-T, which contains tween-20 as detergent, can wash offunbounded antigens and antibodies, including those non-specifically binding. Ifwashing step is omitted, the background index will be higher, and might causeinterference to the result.(3)Why blocking step is essential?After the antigen coating step, the surface of the well is not covered by antigenentirely, i.e. there is still some site leaving blank, which allows other proteins bindto them. Blocking step is to block those blank sites with non-specific bindingmaterial that will not cause interference to the experiment. Thus, the primaryantibody will only bind to the antigen coated in the first step, rather than coat on thesurface as well.(4)What’s the advantage of indirect ELISA comparing with direct ELISA?I.Indirect ELISA can amplify the optical density which we measure.Compared to direct ELISA, the number of secondary antibody binding tothe primary antibody is way larger than the number of primary antibodybinding to the antigen. Thus, optical density will be higher and easier tomeasure, which means a lower error;II.The secondary antibody contains HRP, which is essential for substrate development. Compared to direct ELISA, indirect ELISA need only onekind of antibody contains HRP to perform many kinds of experiment, ratherthan one antibody linked to enzyme for one experiment, which isinconvenient.5Reference【1】/wiki/ELISA【2】/post/9314400054【3】/indirect_elisa。
酶联免疫吸附试验结果
酶联免疫吸附试验结果酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA），是一种广泛应用于生命科学中的试验技术，主要用于检测生物体内特定蛋白质和抗体的存在和数量。
本文将根据不同类别，介绍ELISA试验结果的分析。
一、直接ELISA试验结果分析直接ELISA试验是指将已知抗原沉淀于微孔板上，再加入待检测物，之后加入特定抗体进行检测的试验方法。
当待检测物含有对应的抗原，则抗原和特定抗体结合，形成固定的复合物。
此时，待检测物在微孔板中残留，被进一步检测。
如果待检测物中含有特定抗体，则会与预先添加的抗原结合。
根据特定抗体标记的物质进行检测。
直接ELISA试验结果为同轴柱，并且呈现梯度性图谱。
二、间接ELISA试验结果分析间接ELISA试验是指使用抗原沉淀于微孔板上，加入待检测物，并再次加入特定抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，患者血清或其他样品中含有抗体，抗体与固定的抗原结合，形成复合物。
之后添加特定抗体，间接ELISA试验的结果为同轴柱，并且呈现梯度性的图谱。
三、竞争ELISA试验结果分析竞争ELISA试验是对样品中的特定物质进行检测的试验方法。
在试管中，抗体与已知抗原结合后，特定抗体标记的物质被加入竞争ELISA反应体系中。
如果合适的特定抗体分子与抗原分子竞争结合，则可抑制特定抗体分子与标记物结合，标记物的含量随之减少。
竞争ELISA试验结果为逆向梯度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
四、间接竞争ELISA试验结果分析间接竞争ELISA试验是对患者中特定物质的抗体进行检测的试验方法。
在该试验中，已知抗原沉淀于微孔板上，加入患者样品，之后加入特定抗体。
如果患者样品中含有特定抗体，将与特定抗体竞争结合，导致标记物与它竞争结合量的减少。
间接竞争ELISA试验结果为逆向梯度性的图谱，表示抑制率和特定物质的含量呈反比。
总之，酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于特异性分子识别原理的分析方法，具有操作简单、稳定可靠、敏感度高等特点。
酶联免疫吸附剂测定ELISA实验报告及实验讨论
ELISA实验报告一、实验名称酶联免疫吸附测定二、实验原理在抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物中加入相应酶的底物，反应生成有色产物，然后借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。
待测抗体的定量与有色产生成正比。
三、实验材料与试剂1.抗原Human IgG (0.025mg/ul),一抗Rabbit-α-human IgG,二抗辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。
2.包被液，PBS溶液，封闭液，Tween-20 0.5mL蒸馏水稀释至100mL，邻苯二胺溶液，中止液。
3.聚苯乙烯微量细胞培养板，酶联免疫检测仪，取液器，烧杯，稀释用带凹槽的平板。
四、实验步骤1.将用包被液稀释好的Human IgG加入到培养板以B2至D10为对角线的矩形区域中，200ul/well，B11 C11 D11处不加抗原作为对照，然后在37℃下温育30分钟。
2.取出平板，倒尽液体，然后向B2至D11的矩形区域每个孔中加入200ul的PBS 洗涤液，然后倒掉，如此洗涤3次。
再将平板倒置在吸水纸上，使孔中液体流尽。
3.在B2到D10的矩形区域每个孔中加入0.5﹪的BSA溶液200ul，然后在37℃条件下温育30分钟。
4.Washing with PBS 200ul/well for three times。
具体步骤同步骤2。
5.将first antibody Rabbit-α-human IgG稀释成不同的浓度梯度，200ul/well 按下表加入到平板中。
其中B10 C10 D10不加一抗作为对照，然后incubate at7.在B2到D11的矩形区域中加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200ul，在37℃下温育30分钟。
8. Washing with PBS 200ul/well for three times。
具体步骤同步骤2。
9.向平板B2到D11的矩形区域中加入底物邻苯二胺溶液200ul/well。
10. 向平板B2到D11的矩形区域中加入终止液，每孔50ul。
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大学实验报告酶联免疫吸附试验
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一．实验原理
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。
基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。
当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。
颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。
因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。
本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。
图1 ELISA实验原理示意图
二．实验材料
BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓
冲液、洗涤液（PBS）、底物溶液、2mol/L H
2SO
4。
三．实验方法
1.包被板的处理：加BSA（包被缓冲液稀释为10μg/ml）至酶标板中，每孔100μl，置湿盒中4℃过夜。
第二天取出，用PBS洗涤3-4次。
2.取包被好的酶标板，在第一孔中加入100μl PBS作阴性对照，在第2-8孔加入上述稀释的一抗各100μl，置37℃保温1h。
3.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入二抗各100μl，置37℃保温30min。
4.倾去液体，用PBS洗涤3-4次后加入底物溶液各100μl，在暗处37℃避光显
色20min，最后加入50μl、2M H
2SO
4
终止反应。
5.在波长490nm处，测定各孔的光密度吸收值。
结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
四．实验结果
表1 酶联免疫吸附OD值检测表
目测各孔颜色较浅;检测其OD值结果如上表所示，各孔OD值与阴性对照之比都小于2.1，全部为阴性。
五思考讨论
1.本次实验结果全部为阴性，可能原因有：
（1）抗体制备不成功；
（2）洗涤时可能有部分抗体被洗脱下来；
（3）样品加样量不准确（实验时部分孔是批量加的样且滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，不能保证精确性和均一性）；
2.其它注意事项：
（1）样品和试剂从冰箱取出后，应在室温下(18～25℃)平衡1h。
（2）在操作过程中，加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。
加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。
加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。
溅出会对邻近孔产生污染。
出现气泡则反应液界面有差异。
(3)洗涤时，请勿用带纸屑的吸水材料拍板，以防外源性过氧化物酶类或氧化还原物质与显色液发生反应，影响检测结果的准确性。
（4）包被时间不少于18h，包被板一经洗涤，则不宜存放过长时间。
（5）包被和温育均应将固相载体放置湿盒内进行。
3.BSA免疫血清的制备：可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。
要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫加福氏完全佐剂皮下多点注射
│（一般2.0ml 0.5ml/点）
↓1周后
第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip
│（ip（腹腔内注射剂量不宜超过0.5ml/只）
↓1周后
第三次免疫剂量1.0ml，不加佐剂，ip
│（4天后采血测其效价，检测免疫效果,如果效价不理想可采取加强免疫）
第四次免疫(非必需步骤)
↓1周后
加强免疫，方法: 从耳静脉注射抗原0.1－0.2mL，一周后放血.
ELISA常见方法（1）间接法将已知抗原吸附（又称包被）于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，感作后洗除未起反应的物质，加入酶标记的同种球蛋白（如被检血清是鸡血清，就需用抗鸡球蛋白），作用后再洗涤，加入酶底物。
底物被分解后出现颜色反应，用酶标仪测定其吸光值（OD）。
（2）双抗夹心法用于检测抗原。
将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，再加入被检抗原溶液，使抗原和抗体在固相表面形成复合物。
洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，感作后冲洗，加入酶底物，颜色变化与待测样品中的抗原量成正比。
（3）竞争法用酶标记抗原和未标记抗原共同竞争有限量的抗体的原理，测定样品中的抗原。
同时应用只加酶标记抗原的系统作为对照。
将抗体吸附于固相载体表面，感作后冲洗，加入待检抗原和酶标记抗原。
对照只加酶标记抗原。
感作后冲洗，加入酶的底物溶液，含酶标抗原的对照应出现颜色反应。
而待检系统中，由于样品中未标记抗原的竞争作用，相应抑制了颜色反应。
当待检抗原含量高时，其对抗体的竞争能力强，形成的不带酶的抗原-抗体复合物量亦多，带酶复合物的形成量相对减少，产生的有色产物量也少；反之，待检抗原含量低时，不带酶的复合物少，带酶的复合物量相对增多，最后有色产物的量增多。
除上述方法外，近年来还发展了许多改良方法，如阻断ELISA、LISA、抗体捕捉ELISA等，实际检测中可选择应用。
常用方法具体操作步骤见下表：
表2 ELISA常见方法操作步骤
-20）洗3次，每次5
分钟
3加被检标本：每凹孔
加入用含有0.05%
吐温-20的稀释缓冲
液稀释的被检血清
各0.2ml，37℃，作
用1～2小时
每凹孔加入0.2ml用
稀释缓冲液稀释的
含抗原的被检标本，
37℃作用1～2小
时。
分2组,a组加酶标记
抗原和被检抗原混
合液0.2ml，另一组
只加酶标记抗原液
0.2ml，37℃作用1～
2小时。
（混合液可
作成不同稀释度）。
a组加参考抗体和被
检抗原混合液
0.2ml，另一组加参
考抗体与等量稀释
剂0.2ml，37℃作用
1～2小时。
4洗涤：重复2同左洗涤：同左洗涤
5加入酶结合物：每凹
孔加入稀释缓冲液
稀释的酶结合物
0.2ml 37℃作用1～
2小时
加入0.2ml用稀释缓
冲液稀释的酶标记
特异性抗体溶液，
37℃作用1～2小时
或由预试实验确定
作用时间。
各加入0.2ml抗参考
抗体的酶结合物
37℃作用1～2小时
方法
步骤间接法（测抗体）
双抗体夹心法
（测抗原）
竞争法（测抗原）抑制性测定法
6洗涤：重复2同左洗涤
7加入0.2ml底物溶液
于每个凹孔,(O.P.D
或O.T)，室温作用
30分钟（另作一空
白对照，0.4ml底物
加0.1ml终止剂）。
同左同左同左
8加终止剂：每凹孔加
2M H2SO4或2M柠
檬酸0.05ml。
同左同左同左
9观察记录结果：目测
或用酶标比色计测
定（O.P.D用
492nm）O.D值。
同左
用酶标比色计测定
a、b两组O.D值，
并求出a、b、O.D
值的差数
同左。