第十四章 甾体激素的微生物转化工艺
甾体激素药物的生物转化研究进展
第１７卷第５期２０１９年９月生㊀物㊀加㊀工㊀过㊀程ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＶｏｌ １７Ｎｏ ５Ｓｅｐ．２０１９ｄｏｉ：１０ ３９６９／ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１９ ０５ ０１６收稿日期：２０１９－０５－１３㊀修回日期：２０１９－０６－２９作者简介：徐慧静（１９８３ ），女，内蒙古呼伦贝尔盟人，工程师，研究方向：食品微生物，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｕｉｊｉｎｇｘｕ９９＠１２６．ｃｏｍ引文格式：徐慧静，刘萍，崔立迁，等．甾体激素药物的生物转化研究进展［Ｊ］．生物加工过程，２０１９，１７（５）：５４２－５５０．ＸＵＨｕｉｊｉｎｇ，ＬＩＵＰｉｎｇ，ＣＵＩＬｉｑｉａｎ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｔｈｅｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｓｔｅｒｏｉｄｄｒｕｇ［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇ，２０１９，１７（５）：５４２－５５０．甾体激素药物的生物转化研究进展徐慧静１，刘㊀萍１，崔立迁２，牛建娜１（１ 天津市食品安全检测技术研究院，天津３００３０８；２ 天津市产品质量监督检测技术研究院，天津３００３８４）摘㊀要：甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物㊂在甾体药物或其中间体的合成路线中，微生物转化是不可或缺的关键环节㊂本文中，笔者从微生物转化㊁甾醇侧链降解反应㊁强化生物转化效率的策略等方面对甾体激素药物近几年的研究现状进行综述㊂关键词：甾体激素药物；生物转化方法；生物转化体系中图分类号：ＴＱ４６７ ８㊀㊀㊀㊀文章编号：１６７２－３６７８（２０１９）０５－０５４２－０９ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｔｈｅｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｓｔｅｒｏｉｄｄｒｕｇＸＵＨｕｉｊｉｎｇ１，ＬＩＵＰｉｎｇ１，ＣＵＩＬｉｑｉａｎ２，ＮＩＵＪｉａｎｎａ１（１ ＴｉａｎｊｉｎＦｏｏｄＳａｆｅｔｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３０８，Ｃｈｉｎａ；２ ＴｉａｎｊｉｎＰｒｏｄｕｃｔＱｕａｌｉｔｙＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３８４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｔｅｒｏｉｄｓｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｔｈｅｓｅｃｏｎｄｌａｒｇｅｓｔｃｌａｓｓｏｆｄｒｕｇｓａｆｔｅｒａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｓａｎｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅｋｅｙｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｓｔｅｒｏｉｄｓｏｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｗｅｒｅｖｉｅｗｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｓｔａｔｕｓｏｆｓｔｅｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｄｒｕｇｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓｆｒｏｍｔｈｅａｓｐｅｃｔｓｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｓｉｄｅｃｈａｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｔｏｅｎｈａｎｃｅｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｔｅｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｄｒｕｇｓ；ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ㊀㊀甾体化合物（ｓｔｅｒｏｉｄｓ），也称为类固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核的化合物，侧链上含有不同的基团㊂环戊烷多氢菲母核包含３个六元环（Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ）和１个五元环（Ｄ），结构式见图１［１］㊂几乎所有的甾体化合物母核的第Ｃ１０和Ｃ１３位含有角甲基㊁伯醇或醛基等㊂Ｃ３㊁Ｃ１１㊁Ｃ１７位可能链接羟基（ ＯＨ）或酮基（ Ｃ Ｏ），Ａ环和Ｂ环在不同位置上含有多个双键，Ｃ１７位上连接着结构不同的侧链等［２］㊂当甾体母核上的取代基团和双键位置不相同时，甾体的生理活性差异明显，据此形成了一系列生理功能各异的甾体化合物［３］㊂图１㊀环戊烷多氢菲核Ｆｉｇ １㊀Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅｐｏｌｙｈｙｄｒｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ甾体化合物被誉为 生命的钥匙 ，可调节人体糖代谢㊁脂肪代谢㊁蛋白质合成㊁矿物质代谢及性功能［４］㊂甾体化合物具有分子量小㊁脂溶性大的特点，使其易于进入细胞并产生一系列生理变化，因此，甾体化合物具有成为药物的自然属性［５］㊂在临床上，肾上腺皮质激素是治疗类风湿性关节炎㊁支气管哮喘㊁结缔组织病变和湿疹等疾病的首选药物［６］㊂此外，甾体激素还具有保健的生理功能，如改善蛋白质代谢㊁抗肥胖㊁恢复和增强体力㊁预防冠心病及利尿降压等［７］㊂近年来，甾体药物的应用范围快速扩大，在治疗细菌性脑炎㊁淋巴母细胞白血病㊁人体器官移植㊁预防艾滋病毒（ＨＩＶ）的传染和治疗内分泌疾病等方面也有相应用途［８］㊂甾体激素类药物现已广泛应用成为临床上仅次于抗生素的第二大类药物㊂随着人们对甾体药物的不断研究，甾体药物的高效合成具有非常重要的价值和意义㊂与化学合成相比，甾体药物的生物转化具有如下的特点：①步骤少，周期短；②收率高，副产物少；③专一化强，快速精确地实现化学法难完成的反应；④立体选择性和区域选择性好；⑤绿色安全，无环境污染，条件温和㊂目前生物合成已经成为工业上合成甾体药物的重要途径㊂在甾体药物的生物转化生产过程中，微生物几乎能在甾体化合物的各个位点发生作用，包括甾体母核㊁Ｃ１８和Ｃ１９的两个角甲基及其侧链（图２）㊂图２㊀甾体化合物的主要生物转化位点Ｆｉｇ ２㊀Ｍａｊｏｒｓｉｔｅｓｏｆｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｓｆｏｒｓｔｅｒｏｉｄｓ植物甾醇是我国类固醇药物合成的主要原料，且来源广泛㊂精炼油脂废渣可作为工业化生产类固醇药物的原料，既可提供充分来源又可变废为宝，减轻环境污染㊂甾体化合物的微生物转化反应类型［９］如表１所示㊂甾醇的微生物降解过程中存在三方面的问题：①甾醇疏水性强，分散性差，在水溶液中溶解度低；②甾醇核的降解，产物的进一步降解以及作为微生物利用碳源的甾醇核Ｂ环的自发破坏作用；③产物对细胞的毒性作用㊂如果甾醇以粉末投料会影响甾醇的利用率，且甾醇微生物降解酶是胞内酶，所以在甾醇使用前，需要将甾醇通过相应的媒介扩散到细胞中方能被利用㊂因此，提高甾体转化率的研究主要集中在两个方面：一是使用细胞固定化技术或不同的反应过程来改善类甾体底物的水溶性，提高水相中甾体底物的传质效率；二是利用现代生物技术转化用于生物转化的微生物，提高酶的活性，提高酶反应的选择性［１０－１１］㊂表１㊀甾体化合物的微生物转化反应类型［９］Ｔａｂｌｅ１㊀Ｔｈｅｔｙｐｅｏｆｓｔｅｒｏｉｄｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｂｙｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ［９］反应类型内容氧化反应①羟基化；②醇基氧化；③环氧化作用；④Ｃ Ｃ键的裂开；⑤双键的导入反应；⑥过氧化反应；⑦杂原子氧化还原反应①还原酮到醇；②还原醛到醇；③还原某氢过氧化物到醇；④还原烯醇到伯醇；⑤双键饱和异构化反应①Δ６３酮异构化成Δ４３酮；②Ｄ高环化；③酮重排；④醇差向（立体）异构；⑤５α８α表二氢化合物重排到桥氧醇缩合反应①羟基乙酰化；②糖苷化；③酚醚形成；④胺的乙酰化；⑤甾体生物碱与碳酸相结合水解反应①酯化；②醚开裂引入杂原子反应①氮：由２１位醇基甾体形成２１乙酰胺甾体；②卤素：卤过氢化酶催化导入卤素１㊀甾体化合物的微生物转化１ １㊀微生物转化法的研究皮质激素是第一个微生物转化的甾体药物，它的转化是生物转化的里程碑，开创了微生物转化甾体化合物的先河㊂早在１９５２年Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等利用Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｇｒｉｃａｎｓ中的羟化酶成功的生物转化黄体酮［１２］，在Ｃ１１位上引入１１αＯＨ，转化率高且专一性强，克服了皮质激素合成中难以引入１１αＯＨ的困难，实现了化学方法难以实现的反应㊂Ｐａｔｒｉｃｅ等分别对可的松与泼尼松进行了３种真菌的生物转化［１３］，结果表明，氧孢镰刀菌ＵＡＭＨ９０１３中可能存在Ｃ７和Ｃ１５羟化酶㊂而将这些甾体化合物作为ＥｘｏｐｈｉａｌａｊｅａｎｓｅｌｍｅＵＡＭＨ８７８３的底物，结果显示３４５㊀第５期徐慧静等：甾体激素药物的生物转化研究进展该真菌中存在高活性的５α和１４α羟基化酶，同时具有氧化烯丙基的能力㊂ＣｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓｐａｒａｄｏｘａＵＡＭＨ８７８４对上述甾体化合物进行转化，结果显示单氧酶影响烯丙基的羟基化并且具有ＢＶ氧化重排的活性，然而，氧化还原反应起主导作用㊂Ｒｅｓｔａｉｎｏ等［１４］利用玫瑰产色链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）研究了氢化可的松的生物转化过程，在Ｃ１６位引入１６αＯＨ，得到１６α羟基氢化可的松，它是生产丙酸羟泼尼龙的重要中间体㊂此外，蓝色犁头霉（Ａｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａ）和新月弯孢霉（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ）还可以对醋酸可的松和醋酸泼尼松的Ｃ１１位进行羟基化，再次为皮质激素的生产提供了基础性的突破［１５－１７］㊂甾体激素药物的关键中间体为雄烯二酮（ＡＤ）与雄二烯二酮（ＡＤＤ），大部分甾体药物的生产都以这两种中间体为原料㊂目前对于ＡＤ的生产，主要通过植物甾醇的生物降解，如张亚楠等［１８］开发了利用工业用菌株野生小金色分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｅｏａｕｒｕｍ）催化降解甾醇制备４ＡＤ的无油生产工艺，ＡＤ进一步脱氢即可获得ＡＤＤ㊂大多数真菌对上述两种化合物具有甾基化催化活性，例如：Ｉｓａｒｉａｆａｒｉｎｏｓａ具有广谱的高效类固醇羟化酶，所得到的７羟基脱氢表雄酮具有较高的生物活性，可用于治疗阿尔茨海默病，是合成醛固酮拮抗剂的关键中间体［１９］㊂该菌生物转化孕激素可得到６β，１１αｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，是一种生理活性非常高的孕激素㊂Ｋｏｚłｏｗｓｋａ等［１９］从波兰下西里西亚Ｖｏｉｖｏｄｅｓｈｉｐ地区的废弃矿井中采集到了１２株昆虫病原丝状真菌Ｉｓａｒｉａｆａｒｉｎｏｓｅ，这１２菌株均能有效转化脱氢表雄酮（ＤＨＥＡ），其中ＩｓａｒｉａｆａｒｉｎｏｓａＫＣｈＫＷ１ １可高效转化ＡＤＤ㊁雄烯二酮㊁肾上腺甾酮㊁１７αｍｅｔｈｙｌｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ㊁１７βｈｙｄｒｏｘｙａｎｄｒｏｓｔ１，４，６ｔｒｉｅｎｅ３ｏｎｅ和黄体酮㊂王雪荣［２０］筛选出具有４ＡＤ羟基化能力的４株丝状真菌：斜卧青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）㊁曲霉菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ ）㊁雷斯青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｒａｉｓｔｒｉｃｋｉｉ）和赭曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ），但是这４株菌对４ＡＤ的羟基化位点不同，所产生的产物的生理活性也有差异㊂张广求等［２１］研究了刺盘孢属菌ＹＮＣＡ０１１６对孕酮和４ＡＤ的生物转化，孕酮被该菌转化为１１α，１５α二羟基孕酮和６β，１１α二羟基孕酮，４ＡＤ被转化成１１β，１５α二羟基４雄烯二酮，确定了刺盘孢菌ＹＮＣＡ０１１６具有转化甾体二羟基化的能力，但是对不同甾体化合物羟基化特点不同㊂雷斯青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｒａｉｓｔｒｉｃｋｉｉ）具有１５α羟基羟化酶的特异性，可以催化左旋乙基甾烯双酮１５α位羟基化生成１５α羟基左旋乙基甾烯双酮，而且转化率可以达到９３％以上，该工艺是合成新一代避孕药孕二烯酮所必需的㊂Ｔｏｒｓｈａｂｉ等［２２］利用Ｍｕｃｏｒｒａｃｅｍｏｓｕｓ生物转化甲基睾丸素（ＭＴ），最终可生成７αＯＨＭＴ㊁１５αＯＨＭＴ和１２，１５αＯＨＭＴ这３个产物㊂生物转化１６α，１７α环氧黄体酮（ＥＰ）的研究过程，主要应用Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｇｒｉｃａｎｓ［２３］㊁ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｃｈｒａｃｅｕｓ［２４］㊁Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ［２５］㊁Ｃｕｎｎｉｎｇｎａｍｅｌｌａｅｌｅｇａｎｓ［２６］㊁Ａｂｓｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａ［２７］和Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍｓｐ．［２８］等菌株催化ＥＰ在Ｃ１１位的羟基化㊂此外，ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｌｉｎｉＡＳ３ ４４８６还可以催化ＥＰ生成双羟基产物１β，１５αＯＨＥＰ［２９３０］㊂但目前这些研究，还都处在实验室研究阶段，离工业化应用还有一段距离㊂Ｊａｎｅｃｚｋｏ等［３１］以毛壳菌（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍｓｐ １ＫＣＨ６６５１）作为生物催化剂，黄体酮被高效转化为６β，１４α二羟基雄甾４烯３，２０二酮，而脱氢表雄酮先被转化为７α羟基衍生物，随后转换７羟基雄甾４烯３，１７二酮㊂Ｇａｏ等［３２］利用丝状真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ对３β乙酸基孕甾５，１６二烯２０酮进行转化，生成４种代谢产物，分别为３β，７β二羟基孕甾５，１６二烯２０酮㊁３β羟基７α甲氧基孕甾５，１６二烯２０酮㊁３β，７β，１１α三羟基孕甾５，１６二烯２０酮和３β，７α二羟基孕甾５，１６二烯２０酮，其中７Ｏ甲基化是孕甾生物转化的一个新反应㊂Ｋｏｌｅｔ等［３３］利用Ｍｕｃｏｒｈｉｅｍａｌｉｓ生物转化黄体酮，得到１４α羟基黄体酮㊁６β，１４α二羟基黄体酮和７α和１４α二羟基黄体酮３种产物，总转化率达到９４％，该研究一次反应得到３种羟基化黄体酮衍生物，并且这３种物质均具有工业开发潜力，是生物转化中比较理想的研究结果㊂工业上重要的甾体化合物微生物转化反应类型总结见表２㊂１ ２㊀微生物代谢甾醇的分子机制甾体降解是有氧代谢［３４］，早在２０世纪八九十年代，研究人员就能够根据降解过程中产生的中间产物来研究出可能的代谢途径［３５］㊂随着甾体降解基因簇［３６］的发现，关键酶［３７］的功能已被逐一确定㊂基因簇中的大多数基因与甾体代谢途径有关，其多步降解机制已被人们成功解释㊂４４５生㊀物㊀加㊀工㊀过㊀程㊀㊀第１７卷㊀表２㊀工业上重要的甾体化合物微生物转化反应类型Ｔａｂｌｅ２㊀Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｔｙｐｅｏｆｓｔｅｒｏｉｄｓ反应类型反应底物和产物微生物１１αＯＨ黄体酮ң１１α黄体酮黑根菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｇｒｏｃａｎｓ）１１βＯＨ化合物Ｓң氢化可的松新月弯孢菌（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ）蓝色梨头菌（Ａｂｓｉｄｉａｃｏｅｒｕｌｅａ）１６αＯＨ９α氟氢可的松ң９α氟１６α羟基氢可的松玫瑰产色链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）１９αＯＨ化合物Ｓң１９羟甲基化合物Ｓ球墨孢霉（Ｎｉｇｒａｓｐｏｒａｓｐｈｅｒｉｃａ）芝麻丝核菌（Ｃｏｒｔｉｃｃｕｍｓａｓａｋｉｔ）Ｃ１，２脱氢反应氢化可的松ң氢化泼尼松简单节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）Ａ环芳构化反应１９去甲基睾丸素ң雌二醇睾丸素假单孢杆菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）水解反应２１醋酸妊娠醇酮ң去氧皮质酮中毛棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉｏｌａｎｕｍ）边链降解胆甾醇ңＡＤＤ分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）㊀㊀通过对微生物代谢中间体的鉴定，构建了甾醇生物降解的可能代谢途径，并通过诱变去除了该途径中的关键酶，从而积累中间产物［３８］㊂然而，人们逐渐发现，这种传统的方法会遇到菌株选育的瓶颈㊂由于诱变剂的成功率低㊁作用弱，无法解决突变体和代谢副产物的稳定性问题，很大程度上限制了这类微生物的应用㊂随着分子生物学的发展，人们试图从代谢工程和基因工程等多角度揭示红球菌［３９］和分枝杆菌［４０］等降解甾醇的分子机制，实现人工修饰和调控㊂对此，ｖａｎｄｅｒＧｅｉｚｅ团队的Ｒｏｓåｏｎｉｅｃ等［４１］揭示了红球菌和分枝杆菌甾醇降解的关键基因簇，并解释了一些关键基因的功能㊂同时为研究分枝杆菌感染性的致病机制提供了重要参考［４２］㊂到目前为止，大多数典型的分枝杆菌和红球菌已经被测序，其中一些还通过甾醇诱导的转录组和基因芯片进行了检测［４３］㊂杜大庆［４４］研究发现，微生物体内与甾体代谢相关的基因具有集群化趋势聚集成簇，在甾体诱导下，大多数簇内基因均显著上调㊂在红球菌ＲＨＡ１［４５－４６］中，有６个基因簇被表达上调，其中１个尤为显著㊂Ｐｅｔｒｕｓｍａ等［３９］和Ｋｅｎｄａｌｌ等［４０］研究发现，该簇类包含５１个基因，其中大部分与功能分析鉴定的关键基因高度同源，被鉴定为具有特异性的甾体代谢基因簇㊂１ ３㊀生物转化甾醇的方法甾体化合物的微生物转化过程一般由两个阶段组成㊂第一阶段是对菌体进行培养，通过为菌体提供丰富的营养，使菌体能够在最适宜的温度㊁酸碱度和通风的条件下生长，以获得足够量的菌体和酶㊂培养时间的长短会因菌种的不同而不同，一般来讲，细菌通常需要１２ ２４ｈ，霉菌需要２４ ４８ｈ㊂第二阶段是向培养液中加入甾体化合物来完成生物转化的过程㊂１ ３ １㊀全细胞转化法全细胞生物催化在甾体化合物的工业生产中占有主要地位㊂具有甾体化合物催化能力的酶一般都是氧化还原酶类，通常位于膜蛋白上，在催化过程中还需要辅酶的参与㊂与酶催化相比，全细胞催化避免了成本昂贵㊁步骤繁琐的酶的纯化步骤，而且不需要在体系中额外添加昂贵的辅酶，因此大大降低了生产成本㊂在自然界中，已发现许多微生物如细菌㊁真菌㊁藻类等可以对甾体化合物进行生物转化㊂简单节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）㊁分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）㊁棒状杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）㊁假单孢杆菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）均可以对甾体母核Ｃ１，２位进行脱氢㊂尖孢镰刀菌（Ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ１３０１）菌株可催化多种甾体化合物，且生成睾内酯的产率较高［４７］㊂在众多的微生物中，真菌对甾体药物的转化最为普遍，而且绝大部分都是进行羟基化反应，常用的菌种见表３㊂１ ３ ２㊀静息细胞转化法静息细胞转化是通过制备菌体静态悬浮液来进行的生物催化技术㊂将菌体培养到对数生长期后，过滤或离心收集菌体，再将菌体重悬于水中或适宜的缓冲溶液中，然后加入底物再进行生物转化反应㊂该方法具有如下优点：底物和菌体量的比例可变；杂质相对较少，易于分离纯化；反应时间短；菌体可多次重复利用等㊂例如，当诺卡氏菌氧化胆固醇时，湿细菌的酶活性可以保持在－２０ħ以下，并长期保持稳定㊂徐阳光［４８］利用新金分枝杆菌生长细胞和静息细胞转化体系，对植物甾５４５㊀第５期徐慧静等：甾体激素药物的生物转化研究进展醇转化过程中产物母核降解问题进行研究，发现在静息细胞转化体系中，提高转化温度，甾醇能够正常转化，并且产物降解受到明显抑制，转化３ｄ时，产物降解率由３８ ３１％下降为１６ ２２％㊂通过改用ＡＤ作为底物，发现反应２ｄ后ＡＤ的降解率减少约５０％㊂表３㊀用于甾体化合物羟基化的微生物Ｔａｂｌｅ３㊀Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｕｓｅｄｆｏｒｓｔｅｒｏｉｄａｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ微生物底物羟基化位点棒生杆菌３氧化娠烷４，１１双烯２０羧酸Ｃ９α山扁豆生棒孢ＡＤＣ９α新月弯孢霉化合物ＳＣ１１β蓝色犁头霉醋酸化合物ＳＣ１１β少根根霉黄体酮Ｃ１１α玫瑰色链霉菌９α氟氢化可的松Ｃ１６α棒曲霉１７α乙炔基１１α羟基１８甲基４，５二烯雌烷三酮Ｃ１α寄生毛霉β丁烯酸内酯１４羟基甾醇Ｃ５β根霉５α羟基胆固醇Ｃ６α，β根霉化合物ＳＣ６β棍棒弯孢霉Ｄ高雄甾烷Ｃ６α㊁Ｃ１１β少根根霉β降睾丸甾醇Ｃ７α可可球二孢菌脱氢表雄酮Ｃ７α头孢菌化合物ＳＣ７α绿色木霉孕甾酮Ｃ１７α粗糙脉孢菌ＡＤＣ６β㊁Ｃ７α㊁Ｃ９α毛壳菌睾酮Ｃ６β卵形孢球托霉ＡＤＣ７α㊁Ｃ１４α亚麻刺盘孢脱氢表雄酮Ｃ７α㊁Ｃ１５α赭曲霉沃氏氧化物Ｃ１１α１ ３ ３㊀固定化细胞转化法固定化细胞技术既可以增加菌体浓度又可以重复利用菌体，既能提高催化效率又有利于生物催化剂与产物间的分离㊂固定化细胞技术在甾体生物转化上的应用实现了甾体药物的半连续化生产㊂菌体培养后，投入底物进行转化，随着转化时间的增加，菌体会发生自溶现象，而采取固定化细胞的方法可以解决该问题㊂固定化微生物细胞的方法很多，主要包括包埋及交联㊁载体吸附㊁共价结合等㊂固定化细胞的在甾体生物催化中的效率主要取决于所用载体的性质如表面㊁大小㊁空隙度及亲水性等，另外反应条件㊁固定化方式也会对固定化细胞的活性产生重要影响㊂例如：将新月弯孢霉（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ）先进行底物诱导，收集后的湿菌体固定在聚丙烯酰胺凝胶中，可重复多批次地催化Ｃ１１β羟化反应［４９］㊂而利用聚丙烯酰胺㊁海藻酸等固化剂等进行简单节杆菌的固定，能高效地进行甾体化合物的Ｃ１，２脱氢反应，且批次酶活稳定，能够长期使用㊂另外也可将固定化细胞装在玻璃柱中组成反应柱使反应液连续通过，有效进行Ｃ１，２脱氢反应㊂２㊀甾醇侧链降解反应早在１９８５年，Ｏｗｅｎ等［５０］就对假单胞菌降解甾醇侧链产生ＡＤ的机制进行了研究，经测定，该工艺共分１６步，涉及１１种酶催化剂㊂到１９９０年，Ｓｚｅｎｔｉｒｍａｉ［３５］进一步阐明了分枝杆菌ＮＲＲＬＢ３８０５对Ｐ谷甾醇侧链降解产生ＡＤ的过程和机制，其过６４５生㊀物㊀加㊀工㊀过㊀程㊀㊀第１７卷㊀程主要包括Ｃ３羟基氧化脱氢㊁甾体核上Ｃ５双键异构化㊁Ｃ１７烷基侧链降解㊂反应的顺序还有待确定，但可以肯定Ｃ１７侧链的降解是其最关键的步骤［５１］㊂为了更清楚地了解１１种功能酶参与甾醇侧链降解和酶反应的机制，Ｔｈｏｍａｓ等［５２－５３］㊁Ｗｉｌｂｒｉｎｋ等［５４］㊁Ｇｒｉｆｆｉｎ等［５５］和Ｙａｏ等［５６］研究过一些关键酶的基因和代谢机制㊂特别是Ｇｒｉｆｆｉｎ等［５５］通过高通量转座子突变发现了几个直接参与基因簇内外侧链降解的关键基因㊂Ｙａｏ等［５６］首次阐明了胆固醇氧化酶ＣｈｏＭｌ和ＣｈｏＭ２在分枝杆菌ＡＴＣＣ２５７９５产生ＡＤ（Ｄ）过程中的代谢功能㊁分子机制及重要作用，并提高了关键酶ＣｈｏＭ２的表达，使ＡＤ产量增加５１ ２％㊂然而迄今为止，甾体相关的研究基本上都是基于基因突变或敲除技术来定位甾醇侧链降解过程中的部分关键基因和酶，对全部过程中涉及的１１种功能酶还没有全面的了解，目前甾醇的侧链降解只能在微生物的全细胞内进行，不能实现纯酶催化㊂３㊀生物转化体系强化甾体生产效率３ １㊀水相体系甾体化合物在水中溶解度极低，极大地限制了底物传质进而影响底物与酶的接触，细胞壁和细胞膜作为细胞质的保护屏障，限制了底物进入胞浆的效率，也会降低生物转化的产率［５７－５８］㊂万古霉素㊁卵磷脂㊁氨基乙酸㊁鱼精蛋白㊁乙胺丁醇㊁多粘菌素Ｂ九肽㊁聚乙烯亚胺及杆菌肽等都可导致相关菌株细胞壁的缺失［５９－６１］㊂３ ２㊀双液相体系双液相体系是指水相（发酵液或缓冲液）和与水不溶的有机相（单一有机溶剂或混合有机溶剂）构成的体系㊂水相中含有活性的酶或细胞，有机相中含有甾体化合物㊂在生物转化过程中，形成油包水和水包油两种情况，底物在水相被酶或细胞催化，所得产物再返回到有机相㊂由于底物的溶解度在有机相中要远远高于水中，因此可以大大提高投料浓度㊂由于底物和产物都主要处于有机相中，因此大大降低了底物和产物对酶或细胞的抑制作用㊂同时，在双液相生物转化体系中，有机相主要作为底物的贮存器和产物的原位分离器，随着生物转化的进行，生成的产物不断被转移到有机相中，水相中的反应平衡向产物方向推动，整个反应的转化率得到提高㊂选择合适的有机相是双液相系统技术的关键，一方面有机溶剂对生物催化酶或细胞毒性较小，另一方面有机相对底物和产物有较高的溶解度㊂柏挺［６２］在小试发酵规模上，优化大豆油／水双液相系统中分枝杆菌降解植物甾醇为雄烯二酮（ＡＤ）的工艺㊂研究了大豆油在发酵液中的最佳比例，植物甾醇的投料量以及添加表面活性剂对提高植物甾醇转化率的影响，得到最佳转化工艺条件㊂杨旭锦等［６３］提供一种双液相发酵系统发酵分枝杆菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｓｐ ＤＥ６８２３制备雄烯二酮的方法，在发酵转化完成后，通过膜分离方法，得到含有雄烯二酮的溶液，经浓缩㊁脱色㊁过滤㊁浓缩㊁重结晶和真空干燥等操作，可得到纯度在９９％以上的雄烯二酮㊂根据选用油相的不同，植物甾醇的转化率为５９％ ８５％㊂３ ３㊀双水相体系双水相体系由两种高聚溶液或者一种高聚物溶液和一种盐溶液构成，并在特定的溶液浓度下形成两种不相容相㊂微生物细胞被限定在其中一相中，而底物和产物被限定在另一相中㊂聚合物的存在大大提高了底物和产物在同一相中的溶解度㊂在反应过程中，底物相中的底物（甾体化合物）会不断地进入微生物细胞所在的相中，经过反应生成产物后再转移回底物相中，这样的双水相体系将底物的浓度提高到接近最大反应浓度，又将产物的浓度降低到很低，减少对转化反应的抑制作用㊂在双水相体系中，成相介质的选取是非常关键的，它直接决定了底物和产物在两相介质中的分配情况㊂王艳婷等［６４］将分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）降解植物甾醇制备雄甾４烯３，１７二酮的研究引入双水相体系中，研究表明，双水相体系具有良好的生物相容性，可用于分枝杆菌对植物甾醇降解㊁萃取发酵生产雄甾４烯３，１７二酮，可有效缓解转化过程中的产物抑制作用，其工业应用前景良好㊂３ ４㊀离子液体体系离子液体指完全由离子组成㊁在室温或室温附近温度下成液体状态的盐类，也称为室温熔融盐或室温离子液体㊂组成离子液体的阳离子主要有烷基咪唑离子㊁烷基吡啶离子㊁季铵盐离子等；阴离子主要包括氯化盐类或［ＢＦ４］－㊁［ＰＦ６］－和［ＮＴｆ２］－等㊂许青青等［６５］筛选以离子液体［ｂｍｉｍ］Ｃｌ为代表，构建了液液两相体系，结合高效液相色谱分析测定离子液体复合萃取剂对植物甾醇的分配系数和分离选择性㊂用［ｂｍｉｍ］Ｃｌ－乙腈／正己烷两相体系萃取，７４５㊀第５期徐慧静等：甾体激素药物的生物转化研究进展随离子液体浓度的增加，分配系数和萃取选择性系数的增加十分显著，当用２０％［ｂｍｉｍ］Ｃｌ－乙腈萃取时，豆甾醇的分配系数可达７ ８９，豆甾醇对β谷甾醇的分离选择性可达６５ ８，是纯乙腈为萃取剂时的５４倍以上㊂在生物催化反应过程中，与传统的有机溶剂相比，离子液体具有以下优点：一是为催化体系提供了不同于传统分子溶剂的反应环境，改善生物酶或细胞的活性㊁提高稳定性，提高反应的选择性和转化率；二是离子液体种类繁多，可选择余地大，酶或细胞溶于离子液体中，反应体系可以循环利用，充分表现了酶或细胞的均相催化效率高㊁多相催化易分离的优点；三是离子液体难挥发，操作温度范围宽，并且离子液体与有机溶剂不互溶，使得产物易于分离提取㊂３ ５㊀超临界流体体系在超临界流体体系中，物质具备优异的扩散性能和传质效果，酶催化反应发生在接近临界区域内，温度和压力的微小变化就可使溶剂的性质发生独特的变化，可提高酶催化反应的特异性，目前这一技术在医药工业中引起了越来越多的关注㊂Ｗａｎｇ等［６６］发现，超临界流体在甾体药物合成起始原料甾醇的萃取中表现优异㊂赵亚平等［６７］采用植物油加工副产品为原料，根据甾醇与其他组分在超临界流体中溶解度的差异，进行纯化精制高纯度甾醇㊂萃取剂优选ＣＯ２，并在萃取过程中加入增效剂醇或酮，得到的甾醇纯度高，得率高，而且不引入有害物质，无环保问题㊂３ ６㊀微乳化体系微乳液是将两种或以上互不相溶的液体经混合乳化后，形成的一种热力学稳定㊁透明分散体系㊂在该体系中，生物细胞或酶以分子水平分散于油包水（Ｗ／Ｏ）状的微乳液中，为酶催化提供大量的油／水界面㊂同时，对于难溶性的甾体化合物，由于其可溶于有机介质，可有效克服传质阻力㊂微乳液体系可以提高底物的生物利用度，并且可以将细胞和底物分别保留在水相和油相中，从而将细胞毒性降到最低㊂Ｚｈａｎｇ等［６８］制备了几种不同亲水亲脂平衡的微乳液，并对其稳定性和生物转化效率进行了评价，研究表明微乳液体系中的转化率是传统的水相生物转化系统的３ １倍㊂由于使用微乳液体系的底物细胞毒性较小，该研究实现了利用再生细胞的微乳液进行重复循环生物转化，６个周期的总产量是传统方法的４ ３倍㊂这种高效的微乳液体系，具有更好的细胞可持续性和生物反应活性，可以扩展到其他不溶性和有毒底物的生物转化㊂４㊀结语与展望随着微生物技术的不断发展和新型菌株的应用，甾体激素的生物转化不应只强调提高某一步转化效率和专一性，而且要更多地综合应用多种生物技术（例如合成生物学）来提高甾体激素药物生物合成的途径和方法㊂目前越来越多的具有高转化活性的菌株已经可以通过分子生物学手段对菌株进行改造获得，通过上述甾体药物转化现状的概述，表明转化的成功不仅需要优良菌种，转化体系也至关重要㊂而为了克服有机溶剂对于环境污染及毒性，不同新型 绿色溶剂 ，如离子液体或低溶点共熔溶剂也逐渐应用于甾体药物生物催化体系中，对相关转化方法和转化体系的深入研究，甾体生物转化工业也必然产生新的飞跃㊂参考文献：［１］㊀金俊，卢梦瑶，厉秋岳，等．以甾醇为底物微生物法合成甾体类化合物的研究进展［Ｊ］．食品研究与开发，２０１８，３９（１０）：２０５⁃２０９．［２］㊀ＮＡＳＳＩＲＩ⁃ＫＯＯＰＡＥＩＮ，ＦＡＲＡＭＡＲＺＩＭＡ．Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｒｏｉｄｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃａｔａｌＢｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ，２０１５，３３（１）：１⁃２８．［３］㊀ＧＡＬÁＮＢ，ＧＡＲＣÍＡ⁃ＦＥＲＮÁＮＤＥＺＪ，ＦＥＬＰＥＴＯ⁃ＳＡＮＴＥＲＯＣ，ｅｔａｌ．ＢａｃｔｅｒｉａｌＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＳｔｅｒｏｉｄｓ［Ｍ］ʊＧＡＬÁＮＢ，ＧＡＲＣÍＡ⁃ＦＥＲＮÁＮＤＥＺＪ，ＦＥＬＰＥＴＯ⁃ＳＡＮＴＥＲＯＣ，ｅｔａｌ．Ａｅｒｏｂｉｃｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ，ｏｉｌｓａｎｄｌｉｐｉｄｓ．Ｃｈａｍ：ＳｐｒｉｎｇｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１７：１⁃２２．［４］㊀姚韧辉．甾体类药物的研究现状与进展［Ｊ］．科技风，２０１６（１８）：２６０⁃２６１．［５］㊀ＤＯＮＯＶＡＭＶ．Ｓｔｅｒｏｉｄｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，２０１７，１６４５：１⁃１３．［６］㊀李永清．糖皮质激素的药理作用及不良反应［Ｊ］．北方药学，２０１３，１０（１１）：３２⁃３２，３３．［７］㊀ＳＵＬＴＡＮＡＮ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｂｉｏａｃｔｉｖｅａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｕｓｅｆｕｌｓｔｅｒｏｉｄｓａｎｄｓｏｍｅｓａｌｉｅｎｔｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｓｔｅｒｏｉｄｓａｎｄｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，２０１８，１３６：７６⁃９２．［８］㊀王鸿，周峰，吴祺豪，等．甾体类化合物生物转化的研究进展［Ｊ］．浙江工业大学学报，２０１５，４３（５）：５５６⁃５６１．［９］㊀张艺．节巧菌催化遵体化合物Ｃｌ，２脱氮规律的研究［Ｄ］．天津：天津科技大学，２００９．［１０］㊀ＤＯＮＯＶＡＭＶ，ＥＧＯＲＯＶＡＯＶ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｅｒｏｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｓｔａｔｅａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，９４（６）：１４２３⁃１４４７．８４５生㊀物㊀加㊀工㊀过㊀程㊀㊀第１７卷㊀。
甾体化合物的生物转化
O
O
孕酮
根霉菌
O HO
O
11-羟基孕酮
O
HO
OH
O
皮质醇
O OH
O
OH
O
皮质酮
内容
1、概述 2、酶催化和微生物催化的反应类型 3、甾体生物转化的主要反应 4、代表性实例 5、结束语
1、 概述
生物转化（Biotransformation）是指利用生物体系以及它们所 产 生 的 酶 对 外 源 化 合 物 （ exogenous substrate, foreign substrate, xenobiotics compound）进行结构修饰而获得有价 值产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对 外源化合物进行酶促催化反应。生物转化具有反应选择性强（位置 选择性 regio-selectivity 和立体选择性 stereo-selectivity）、 高效率、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染、后处理简单 等优点 。迄今，在生物转化研究领域已取得了很大的进展。生物 转化不仅应用于有机合成的研究中，而且还应用于植物次生代谢产 物的结构修饰、活性先导化合物的寻找及药物构效关系的探索等研 究中，被称为“绿色化学，green chemistry”，用于药物开发、 环境净化等科学领域，有着重要的理论意义及实际应用价值。
COOH O -呋喃甲酸
(4)
OH
O
C
C
H
乙酸杆菌属
OH
O
环戊酮
(5)
CH3
CHO
CH3 假单孢菌
CHO
OH
OH
4-羟 基苯 甲 醛
(6)
CH3
COOH
甾类激素药物的生产
生物技术控制途径
① 通过底物-甾体结构的修饰； ② 在微生物降解过程中加酶抑制剂； ③ 通过诱变技术获得生化阻断突变菌株。
甾体激素 的生产工艺过程
甾体的微生物转化和一般的氨基酸、抗生 素的生产不同 发酵的产物不是目的产物，而只是利用微 生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定 的化学反应来获得一定的产物。
微生物转化避免和减少了强酸、强碱或化 学有毒物质，改善了生产环境。 目前一般采用化学合成和微生物转化两种 方法相结合的生产工艺。
微生物转化反应原理
微生物对甾体所转化部位：几乎每个位置 都能进行转化。 甾体激素药物合成比较重要的转化反应：
一、氧化反应 二、还原反应 三、水解反应等
一、羟化反应
四、甾核及边链的选择性降解机理
具有生理活性甾体类药物的基本母核目前 都是从高等动植物中获得 首先必须有选择性地对其边链进行降解。 化学法选择性差，产率低。目前，多采用 微生物转化法。
甾体药物的天然资源
薯蓣皂苷元（约占60%） 豆甾醇（约占15%） 胆甾醇 β-谷甾醇
甾核边链的选择性降解的应用
（乙）
甾体微生物转化的两个阶段
第一阶段：微生物生长阶段
第二阶段：底物转化阶段来自第一阶段：微生物生长阶段
它是将菌种接入斜面培养基或小米培养基 培养3～5d→将成熟的菌种细胞或孢子接入 摇瓶或种子罐，给予合适的温度、溶氧浓 度、pH值等条件培养，使其充分繁殖与生 长。培养时间的长短随菌种和环境而异， 细菌的生长期12～24h，真菌为24～72h。
甾类激素药物的生产
CH3 C O HO
Rhizopus Nigricans ATCC 62276
O
O
新月弯孢霉（Curvularoa lunata）能将 Reichstein S化合物（简称化合物S， Compound S）一步转化成氢化可的松
CH2OH C O
CH2OH HO
新月弯孢霉
C O OH
O
化合物S
工业上通过生物技术来控制微生物选择性地 降解甾体边链以获得甾类药物的前体物。
生物技术控制途径
① 通过底物-甾体结构的修饰； ② 在微生物降解过程中加酶抑制剂； ③ 通过诱变技术获得生化阻断突变菌株。
甾体激素 的生产工艺过程
甾体的微生物转化和一般的氨基酸、抗生 素的生产不同 发酵的产物不是目的产物，而只是利用微 生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定 的化学反应来获得一定的产物。
发酵：将玉米浆、酵母膏、硫酸铵、葡萄 糖及水投入发酵罐中搅拌，用氢氧化钠溶 液调整物料pH值到5.7～6.3，加入0.03%豆 油，灭菌温度120℃，通入无菌空气，降温 至27～28℃，接入犁头霉孢子悬浮液，维 持罐压0.6kg/cm2，控制排气量，通气搅拌 发酵28～32小时。用氢氧化钠溶液调pH值 到5.5～6.0
甾体上羟化对化学合成而言是非常困难的， 除了C17位上通过化学方法能导入羟基外， 其它位置很难导入。
通过微生物羟化酶能非常专一地选择某个 碳位置上将某空间位置上的氢取代氧化成 原来空间构型的羟基。
如孕酮的转化中，利用黑根霉在温度不超 过320C时成功地实现了C11α羟基化反应。
CH3 C O
适宜的发酵条件主要包括
（1）搅拌 搅拌可增加传质和传热，可以增加培 养基的氧气供给，使氧气均匀分散而提高转化率。 （2）通气 可直接增加氧气的供给。有研究表明， 溶解氧量对诱导酶产生非常重要。 （3）前体半连续的加入 可以降低由于一次大量 加入所引起的毒性，也可减少由于发泡所引起前 体的损失。
甾体微生物转化在制药工业中的应用
结论
甾体微生物转化是制药工业中的重要技术，具有广泛的应用前景和潜力。本 次演示介绍了甾体微生物转化的概念、应用举例、关键技术和发展前景。通过研 究高效转化技术、基因工程技术的应用、绿色环保技术的推广以及生物传感器的 应用拓展等方面，可以进一步提高甾体微生物转化的产率和产品质量，降低生产 成本和环保负担，为制药工业的发展和人类健康做出更大的贡献。
1、高效转化技术的研发
研究高效转化技术是提高甾体微生物转化产率和降低成本的关键。未来，将 进一步探索和优化微生物培养条件和转化反应器性能，提高转化效率和产品质量。
2、基因工程技术的应用
基因工程技术可以用于改造微生物的酶系，提高其转化能力和产率。未来， 将进一步探索和开发基因工程技术，以实现高效、环保的甾体微生物转化过程。 3.绿色环保技术的推广
2、疫苗制备
在疫苗制备中，甾体微生物转化技术可以用于制备疫苗佐剂。佐剂可以提高 疫苗的免疫原性，增强机体免疫力。例如，氢氧化铝佐剂可以与流感病毒结合， 提高流感疫苗的保护效果。
3、生物传感器制备
甾体微生物转化技术还可以用于生物传感器制备。生物传感器是一种用于检 测和分析生物样本的装置，具有高灵敏度、高特异性和低成本等优点。例如，基 于甾体微生物转化技术的葡萄糖生物传感器可以用于糖尿病患者的血糖监测。
研究背景
甾体微生物转化是指利用微生物酶系将甾体化合物转化为更有价值的产品。 在制药工业中，甾体药物具有广泛的应用，如抗生素、激素、免疫抑制剂等。因 此，甾体微生物转化技术在药物研发和生产中具有重要意义。此外，甾体微生物 转化还可以用于环境治理、农业生产等领域。
应用举例
1、药物代谢
甾体微生物转化技术在药物代谢研究中的应用较为广泛。通过将药物进行微 生物转化，可以发现新的药物候选物，或者提高药物的疗效和降低副作用。例如， 利用甾体微生物转化技术可以将紫杉醇类药物进行生物转化，提高其抗癌活性。
甾体的生物转化
甾体的生物转化
甾体是一类含有四个环的有机化合物，包含胆固醇、类固醇等，广泛存在于生物体内。
甾体的生物转化是生物化学领域中非常重要的一个主题。
它能够帮助我们深入了解生物体内多种生理过程。
甾体主要的生物转化有以下几个步骤：
1. 羟化反应
甾体在生物体内最初的代谢反应是羟化反应。
该反应是由内质网中的酶催化完成的。
具体来说，细胞通过合成一定数量的酶，将甾体中的一部分甙类化合物（如甾醇）转化为对应的羟化物（如羟胆固醇）。
羟化反应是甾体合成的重要反应，在细胞内广泛应用。
2. 氧化反应
在羟化反应完成后，甾体进一步参与氧化反应。
氧化反应由内质网中的酶催化完成。
通过一系列复杂的反应步骤，甾体中的碳、氢等原子重新排列，形成新的分子结构。
这些新分子结构可以帮助细胞进行生理过程。
3. 质子化反应
质子化反应是甾体生物转化的最后一步。
在质子化反应中，甾体分子的化学结构发生变化，多个质子被甾体分子吸收，原子间化学键发生变化。
这些变化使得甾体分子具有更加复杂的分子结构和生理功能。
甾体的生物转化对生物体的生长和发育中起着重要作用。
通过对甾体的生物转化过程的研究，人们可以更好地理解某些生物体内生理现象的发生机制，更好地把握生物发育规律，推动生物医学等领域的发展。
生物转化法制备9αOHAD
生物转化法制备9αOHAD本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！甾体化合物的概述甾体化合物（steroids）又称类固醇化合物，是环戊烷多氢菲类化合物的总称[2]。
其普遍存在于动物、植物组织和微生物细胞中。
甾体化合物一般都含有一个由四个环A、B、C和D稠合组成的基本骨架，A、B、C环为六元环，D环为五元环，这个骨架就是甾族化合物的母核，即环戊烷多氢菲。
将17个碳原子按特定顺序编号。
通常A/B环稠合处和C/D环稠合处各有一个角甲基，在D环17位有侧链[3]。
第3、11、17位可能有酮基（-C=O）或羟基（-OH），A环或B 环存在部分双键，大多数甾体化合物由于甾体母核上取代基、双键位置和立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。
[4,5]其结构通式为：图1-1 甾体化合物的结构通式Fig 1-1 The basic structure of steroids随着甾体类药物在医药领域需求量的不断增大，其制备技术也得到了越来越广泛和深入的研究。
甾体类药物大多为在医药上占有重要地位的激素类药物，如氢化可的松（又名皮质醇，Hydroeortisone），皮质酮（Corticosterone），睾酮（Testosterone）、雄酮（Androsterone）、雌二酮（oestradiol）和孕酮（progesterone）等，对机体起着非常重要的调节作用，如肾上腺皮质激素能缓解或治疗胶原性疾病、过敏性休克等危险或难治的疾病，以及治疗阿狄森氏病等内分泌疾病。
各种性激素药是治疗雄性器官衰退和妇科疾病的主要药物，是治疗前列腺癌、乳腺癌的辅助治疗药物，同样也是近年来市场需求旺盛的口服避孕药的主要成分。
因此，甾体类药物在临床医学上占有重要地位。
其大致分类如下：（一）类皮质激素（Corticoid），如：氢化可的松、可的松、地塞米松、强的松、泼尼松、氟轻松等。
甾体生物转化羟化反应的机理及条件研究
甾体生物转化羟化反应的机理及条件研究某某（成都理工大学化学工程与技术）摘要：甾体化合物普遍应用于医学等领域，具有不可替代的作用。
对于甾体化合物的生物转化又是其合成主要方式。
文中讲述了甾体化合物生物转化中的羟化反应及其相应条件影响等。
关键词：甾体化合物; 生物转化; 羟化反应。
甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是环戊烷多氢菲类化合物的总称。
甾体化合物具有各种生物活性，由于甾体母核上取代基位置种类不同、双键位置或者立体构型等不同，形成了一系列具有独特生理功能的甾体化合物衍生物[1]。
甾体化合物种类繁多，普遍存在于自然界中，成千种甾体化合物已经被报道存在于一些生物体中。
比较常见的有：植物组织中的薯芋皂素类、大豆甾醇和油甾醇；昆虫中的蜕皮甾体；动物组织中的糖皮质激素、盐皮质激素类、雌二醇，孕酮和雄酮等性激素、胆固醇、胆酸等；还存在于酵母和霉菌等低等生物中，如麦角固醇等[2]。
甾体化合物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。
近年来，甾体化合物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等[3]。
而生物转化是利用生物体系将加入到反应系统中的外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰以获得有价值的不同化学产物的工艺[4]。
生物转化涉及的反应类型很多,如加氢、脱氢、氨化、脱氨、酞化、轻化、脱梭、水解、缩合、环氧化、酞胺化;卤化、酷化、脱水、甲基化、磷酸化、糖基转移反应以及底物分子的歧化、异构化、消旋化等[5]。
生物转化已经成功地应用于甾体化合物的研究与生产中，特别是甾体的羟化反应。
最早应用于工业生产的羟化反应就是利用黑根霉转化黄体酮生成Ⅱα羟基衍生物。
本文概述在生物转化甾体化合物中羟化反应的研究进展。
1 羟化反应机理同位素示踪试验的研究表明，转化到甾体化合物上的羟基是直接取代甾体碳架上的氢位置，并且取代过程中没有发生立体构型的变化，也不是通过形成烯的中间体来完成的，即羟基取代的立体构型(α或β构型)是由氢原子原来所处的空间位置决定。
甾体的微生物转化
微生物选择性地修饰或改造甾体化合物分子结构的作用
目录
01 研发史
03 提高应用效率
02 反应部位 04 其他信息
基本信息
甾体的微生物转化(microbial transformation of steroids)微生物选择性地修饰或改造甾体化合物分子 结构的作用。它是通过微生物产生的酶催化进行的。
反应部位
反应部位
一种微生物可在同一甾体的不同部位产生不同类型的反应，也可在不同结构的甾体化合物上发生同一类型的 反应。各种不同的微生物又能在同一种甾体上产生相同的转化反应，也可产生不同的反应。
在甾体药物的工业生产中，国内外采用微生物转化的反应有-羟基化、11β-羟基化及16 -羟基化A环-或-和 -位的脱氢,-位羟基的脱氢，-或-位酯的水解以及-位侧链的降解、不对称还原-位酮基等，它们都分别在各种 皮质激素、性激素、口服避孕药、蛋白同化激素、抗癌剂、利尿剂等药物的合成中成为关键步骤。
研发史
研发史
1937年L.马莫利和A.韦瑟洛纳曾发现 1株酵母能还原甾体17碳位上的酮基为17β-羟基。1943年,G.E.屠飞 特发现诺卡氏菌能彻底降解胆甾醇。但微生物转化甾体化合物的能力，直到在可的松合成中被采用后才引起人们 的重视。可的松是一种皮质激素药物，具较强的抗炎活性。1952年，美国普强药厂的生物化学家D.H.彼得森和微 生物学家H.C.默里发现少根根霉能使孕酮的11碳位羟基化，生成11-羟基孕酮，而后又用黑根霉转化，获高达95% 的得率，大大降低了可的松的成本。不久，科学家们又相继发现细菌、真菌、放线菌中的某些种，可以使一定结 构的甾体化合物在一定的部位上发生分子结构的改变。这种酶促反应具有严格的底物特异性，一般能使底物分子 上1个或2个基团起反应，而并不需要对其他基团进行保护，有的还能把手征性的中心引入光学上无活性的分子中。 至今已发现微生物转化甾体化合物的反应类型，几乎包括任何已知的微生物酶促反应和已经发现的化学反应，如 氧化、还原、水解、缩合、异构化、新的碳碳键的形成以及杂基团的导入等。通常，一个酶促反应可以代替几个 化学反应步骤，这就使甾体药物的合成工艺变得更有效并更经济。
甾体1,4-脱氢和11α-羟基化反应的两种不同微生物转化
一点看，如果两菌分别以两步转化，则需将第一步脱氢反应
的中间产物分离出并引入乙酰基后，才适合于作为第二步羟
基化反应的基质，这在工艺上是比较繁琐的，也是很不经济
的。综上所述，从简化工艺、缩短周期以及提高收率等方面，
节杆菌与犁头霉两菌一步连续转化比两菌分别以两步转化
优越。
参考文献
［*］ T88A@，?WX,Y，ZV4!6? [!"#$%&’!()*+,-.*-$，*.1.，$$（*）：*’(!*(% ［#］ 近藤荣二J化学与生物，*.E+，%&（*.）：1$+!1*% ［%］ \8PM4I2P@J’!,-//!(，*.E+，#E*(+(’ ［’］ 陈家任，蒲自莲，曾本秀等J微生物学报，*..*，#%（’）：%$+!%*’ ［(］ ?6XKK8B?，TW7CV8K]3N ;，=6BB3K=!"#$%&0,123!4，*.11，#%（*）：#1!%* ［1］ 法幼华，徐诗伟J微生物学报，*.+$，!’（#）：*+(!*.$ ［E］ 徐诗伟，法幼华J微生物学报，*.+’，!(（*）：’1!’.；*.+(，!$（#）：*+*!*+#；*..$，#’（*）：+$!+# ［+］ 徐诗伟，徐 清，法幼华J生物工程学报，#$$$，%&（’）：’+#!’+’ ［.］ ;6MX!28BZ@J566$)*+,-.*-$7*-"!+3，*.+(，!%：*(’!*1*J ［*$］ T88A@，AB4^7[ _，?WX,Y!"#$%7*-"!+37*-!(1，*.E*，%#：($%!(*(J ［**］ 王敬一，张丽青，马如鸿等J药学学报，*.+E，!!（#）：*’*!*’’J
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
甾体微生物转化方式
进行微生物转化反应可以利用不同形式的微生物细胞。 ?菌体培养物（单菌体或混合菌体培养液） ?静止细胞悬液（使菌体充分生长发育后，用过滤或 离心法进行分离，将收集到的菌体悬浮在水或适当的 缓冲液中，再将甾类化合物加入进去。） ?孢子悬液 ?干细胞 ?固定化细胞或固定化酶等。
氢化可的松的制备
氢化可的松（Hydrocortisone）又称为皮质醇，化学 名称为11β，17α，21-三羟基孕甾-4-烯-1，20-二酮。其结 构式为
氢化可的松为白色或几乎白色的结晶性粉末， 无臭，初无味，随后有持续的苦味，遇光逐 渐变质，略溶于乙醇或丙酮，微溶于氯仿， 在乙醚中几乎不溶，不溶于水。熔点为 212~222℃。
药物，在医学上应用非常广泛，特别是甾体激素类药物，应
用在风湿性关节炎，控制炎症，避孕，利尿等各方面的治疗
上，对机体起着非常重要的调节作用。甾类激素根据其生理
活性可分为肾上腺皮质激素，性激素和蛋白同化激素三大类。
甾体化合物的基本结构如下：
甾类激素药物的生产， 目前一般采用化学合成 和微生物转化两种方法 相结合的生产工艺。
甾体母核及边链的选择性降解机理
具有生理活性甾体类药物的基本母核目前都是从高 等动植物中获得的，首先必须有选择性地对其边链进行 降解。
甾醇边链降解机理与脂肪酸的 β氧化途径相似。胆 甾醇的边链降解从 C27羟基化开始，再氧化成 C27羧醇， 继后 β氧化先失去丙酸、醋酸，最后再失去丙酸，形成 C17酮化合物，最后一步转化为脱氢，加水和开裂。
2
1
A
11
12 13 17
CD
10 9
B
8 14
16 15
3 甾体化合物的基本结构
第二节 微生物转化反应原理
微生物几乎对甾体每个位置都能进行转化，其中 对甾体激素药物合成比较重要的主要有氧化反应、还 原反应、水解反应等。其中氧化反应又包括甾体骨架 上的羟基化和脱氢（生成双键）、甾醇氧化成甾酮、 支链降解作用以及 D环的切断和 D环开裂形成内酯环 等。
甾体的微生物转化生产流程
甾体的微生物转化两个阶段。生长阶段，它是 将菌种接入斜面培养基或小米培养基培养 3~5d，然 后将成熟的菌种细胞或孢子接入摇瓶或种子罐，给 予合适的温度、溶氧浓度、 pH值等条件培养，使其 充分繁殖与生长。转化阶段是在微生物生长的终点， 逐渐将甾体的粉末或适当的（有机）溶液加到培养 物中，或把成熟细胞分离洗涤，然后悬浮于水或缓 冲液中，再将底物加入，加入方式如图。大多数甾 体化合物难溶于水，所以常用的方法是先把底物溶 于有机溶剂，如丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺， 浓度在 2%对微生物无毒性。或用表面活性剂（如吐 温80）来提高基质溶解度。
甾体母核的降解，先在 C3进行酯化， 3β-羟基氧化 后接着Δ5双键被异构酶催化转位为 Δ4双键，但此步异构 化也可发生于非酶催化。在 3-酮-4-烯化合物 9α-羟基化 后，随着C-1(2)-脱氢同时，甾体母核A环芳香化并导致β 环开裂。
第三节 甾体激素的生产工艺过程
甾体的微生物转化和一般的氨基酸、抗生 素的生产不同，发酵的产物不是目的产物，而 只是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进 行特定的化学反应来获得一定的产物。整个生 产过程，微生物的生长和甾体的转化完全可以 分开，一般先进行菌的培养，在菌生长过程中 累积甾体转化所需要的酶，然后利用这些酶来 改造分子的某一部位。
? C11α羟化
C11α羟化是微生物转化的特有反应。如孕酮的转化中，利用黑根霉在温 度不超过320C时实现C11α羟基化反应。温度的控制很重要，生产过程中 温度超过320C，黑根霉只会大量生长菌丝而不对孕酮进行C11α羟化。过 程伴随有微量副产物出现。
环氧化反应
用微生物转化法在甾体母核上引入环氧基团的 反应与微生物羟基化有关。能产生 11β-羟基化的新 月弯孢霉或布氏小克汉银霉都可将 17α，21-二羟基4，9（11）-孕甾二烯-3，20-二酮转化成 9β，11β 环氧化合物。
氢化可的松为皮质激素类药物，具有影响糖代谢、抗 炎、抗毒、抗休克及抗过敏等作用。主要用于肾上腺皮质 功能不足和自体免疫性疾病。应用于某些感染的综合治疗。 消化性溃疡病、骨质疏松症、精神病、重症高血压患者忌 用，充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病慎用。
? 反应原理
在产物中，除了氢化 可的松（简称β体） （b）外，还产生 11α-羟基化合物即表 氢可的松（又称为α 体）（c）、少量的
羟化反应
? C9α 羟化
C9α羟化在甾体药物合成中是一个关键中间步骤，涉及到甾体边链的 选择性降解，并且是皮质激素合成中一个关键中间体。由于C9位上导 入羟基后，容易在C9—C10之间引入双键，然后进一步形成C11β羟基 或导入氟原子。例如甾体合成中重要中间体9α-羟基-4-雄甾烯-3，17
双酮和9α-羟基-3氧化娠烷-4，17双烯-20羧酸的制取。
脱氢反应
微生物对甾体C1，C2位是直接脱去C1，C2位上的氢。微生物对甾 体羟化与脱氢能力是相反的，细菌的脱氢能力比真菌大，特别是棒状杆 菌和分枝杆菌活力最大。球形芽孢杆菌，诺卡氏菌对可的松和皮质醇也 有较高的脱氢活力。而对甾体母核有脱氢活力的微生物，常伴随边链降 解和C26位酮基还原以及其C9α羟化引起β环打开等作用。
甾体氧化需要较大的通气量，一般为1：0.8（v/v/min）。 甾体加入的速度随菌种转化能力和基质的性质而定，采用基 质的定期加入和连续加入的办法来解决基质或产物的毒性问 题。转化后的产物大多不溶于水，所以采用溶媒萃取法进行 提取。微生物转化生产甾体化合物一般采用二级培养，其工 艺流程如下。
如果产物分泌在发酵液中，则发酵滤液采用离子交换 树脂吸附法吸附甾体化合物，洗脱后，减压浓缩进行结晶。
第十四章 甾体激素的微生物 转化工艺
第一节 概述 第二节 微生物转化反应原理 第三节 甾体激素的生产工艺过程
化学工业出版社
学习目标
?了解甾体激素种类及其微生物转化反 应原理； ?熟悉甾体激素的生产工艺过程； ?掌握氢化可的松的生产技术。
第一节 概述
? 认识甾体激素
甾类药物是指分子结构中含有环戊烷多氢菲核的一类