血友病的基因诊断
血友病携带者与产前基因诊断_陆晔玲
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中国输血杂志 2008年 4月第 21 卷第 4期 ChinJBloodTransfusion, April, 2008, Vol.21, No.4
血友病 A(HA)和 B(HB)是常见的遗传性出 血病 , 呈 X性联隐性遗传 。由于缺乏根治措施 , 故 作携带者和产前诊断可避免血友病胎儿的出生 , 对 提高人口素质 , 减轻社会负担有重要意义 。 我们通 过对 HA家系作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 , 对 HB家系用直接核苷酸测序确定 F9基因突变 , 并联合应用对 2个基因相应 STR位点的遗传连锁 分析 , 建立了 1种简便 、快速的血友病携带者检测 与产前诊断的方法 , 现报道如下 。
陆晔玲 1 丁秋兰 1 戴菁 1 王鸿利 2 奚晓东 3 王学锋 1 (1.上海交通大学医学院附属瑞金医院 临床输血科 , 上海 200025;2.上海血液学研究所 ;3.基因组学国家 重点实验室 )
摘要 :目的 建立 1种简便 、快速的血友病携带 者检测 与产前 诊断体 系 。 方法 对 38 个血友病 A家系 , 用 长链 PCR及序列特异 PCR作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 ;有家族史家系可联合 F8基因 内外的 8个多态 性 位点进行遗传 连锁 分 析 , DXS52(ST14)位 点多 态 性以 PCR产物 凝 胶 电 泳法 检 测 , 7 个 STR位 点 (F8Civs13、 CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的 多 态性 以多 重荧 光 PCR法检 测 , 产 前诊 断 加用 性别 位 点 (Amelo);对于散发家系 , 通过直接核苷酸测序查找先证者的基因 突变 , 继而对 家系女 性成员作 携带者 与产前 诊 断 。 对 12个血友 病 B家系采用直接核苷酸 测序法确定基因突 变 , 多重 荧光 PCR法检测 F9基因外 6 个 STR位 点 (DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性 。 结果 38个血友病 A家系 中 , 10名 先 证者的 F8基因内含子 22倒位检测为阳性 , 1例先证者为 F8基因内含子 1倒位阳性 , 对于有家族史的家系 , 综合 应用倒位检测和遗传连 锁分析 , 携带者与产前诊断率均为 100%;4个散发家系 均可找到 致病突变 ;38个血友 病 A家系的携带者及产前 诊断总诊断率为 94.81% 。 12 个血友 病 B家 系中有 10个家 系通过 直接 测序可 找到 突 变 , 联合 F9基因外 6 个 STR位点对血友病 B家系的遗传连锁分析的可诊断率为 96.88%。 结论 F8基因内 含 子 22及 1倒位筛检联合 F8基因内 、外多个位点 的遗传连锁分析可 以进行血 友病 A的 携带者及 产前诊 断 ;直 接 核苷酸测序可确定 F9基因突变 , 而联合基因外多个多态 性位点检测并进行遗传连锁分析 , 是血友 病 B携带者 检 测与产前诊断的简便 、快速的方法 。 关键词 :血友病 ;携带者检测 ;产前诊断 ;倒位检测 ;核苷酸测序 中图分类号 :R457.1 文献标识码 :A 文章编号 :1004-549X(2008)04-0259-06 Carrierdetectionandprenataldiagnosisofhaemophilia LUYeling, DINGQiulan, DAIJin, etal.Departmentof Transfusion, RuijinHospital, Shanghai200025, China AbstractObjects Toestablishasimple, rapidcarrierdetectionandprenataldiagnosissystem forhemophilia. Methods Thirty-eightHAfamiliesweretestedfortheintron22 and1 inversionsinfactorVIIIgenebyLD-PCRand PCR.Theremaininginversionnegativefamilies, butwithfamilyhistory, werescreenedusinglinkageanalysiswith8 combined polymorphic markers, including St14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073, and DXS1108.Forsporadicfamilies, thewholegenesequencingwasapplieddirectlytodetectthemutation.ForHBfamilies, linkageanalysiswith6 STRs, includingDXS1192, DXS1211, DXS8094, DXS8013, DXS1227 andDXS102, wasappliedtogetquickdiagnosticinformation.Thewholegenesequencingwasusedtogetthefinaldiagnosis.TherapidfluorescentPCRcombinedwithpolymorphism markerswereappliedforlinkageanalysisinHAandHBfamilies, respectively.Assoonasthepregnancywasidentified, additionalAmelositedetectionwouldbeperformed.Results In38 HA families, introns22 and1 inversionswerefoundin10 and1 probands, respectively.ThediagnosticratesofSt14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073 andDXS1108 were61.11%, 76.67%, 71.43%, 70.59%, 62.50%, 10.00%, 75.00% and50.00%, bininginversiondetectionandlinkageanalysis, thediagnosticrateofcarrierdetectionandprenataldiagnosisoffamilieswithHAfamilyhistorywereboth1 00%.Oneintron22 inversionand3 mutationsweredetectedin4 sporadicfamilies.Thetotaldiagnosticrateof38 HAfamilieswas94.81%. And10 mutationsweredetectedinthe12 binedwiththelinkageanalysis, thetotaldiagnosticratewas 96.88%.Conclusions Introns22 and1 inversionscreeningcombinedwiththelinkageanalysis, usingthehighlyinformativepolymorphicmarkers, canbeusedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisinChineseHAfamilies.ThedirectsequencingofFⅨ withthelinkageanalysiscanbesuccessfullyappliedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisof HBfamilies. Keywords:Haemophilia;Carrierdetection;Prenataldiagnosis
可治性罕见病—血友病
可治性罕见病—血友病一、疾病概述血友病是一种x染色体连锁隐性遗传性出血性疾病，由于编码凝血因子的基因异常而导致凝血因子FⅧ或FⅧ生成障碍，表现为自发性出血或轻微损伤后出血不止。
其中凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺乏为血友病A(hemophilia A,HA)；凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺乏为血友病B(hemophilia B,HB)。
通常女性携带，男性发病。
人类Ⅷ因子基因定位于Xq28，基因跨度超186 kb，由26个外显子（占9 kb）及25个内含子(占177 kb)组成，编码2351个氨基酸，已发现缺失型（包括错义、无义及移码突变等）共46种以上[1]。
血友病B也呈x连锁隐性遗传，但血友病B有明显家族史者少，故此基因似有高度的自发性突变率。
人类Ⅷ因子基因定位于Xq27 11，基因总长度34 kb左右，由8个外显子组成。
已鉴定出的突变100种之多（部分缺失及全缺失者30种，其余为各种类型点突变）[2]。
1986-1989年在全国24省市的37个地区所进行的流行病学调查显示，我国血友病患病率为2. 73/10万，与欧美相比较低[3]。
二、临床特征血友病患儿绝大多数为男性，临床特点是延迟、持续而缓慢的渗血，出血频度与部位取决于患儿体内的凝血因子水平。
血友病的出血在各个部位都有可能发生，以膝、踝、肘和肩等大关节出血最为常见，肌肉出血次，内脏出血少见，但病情常较重。
除颅内出血外，出血引起的突然死亡并不多见，但年幼儿可因失血性休克致死[4]。
患儿首次出血常为学步前皮肤、软组织青斑、皮下血肿；走路后关节、肌肉出血开始发生，若此时无有效替代治疗，关节出血常反复发生并在学龄期后逐步形成血友病性关节病，不仅致残而且影响患儿就学及参与活动，影响其心理发育。
上述疾病演变过程常为重型患儿特点，但在没有及时接受替代治疗的中型患儿中也常见。
血友病A和血友病B的临床表现相似，确诊及两者的鉴别主要依赖实验室检查。
三、诊断血友病的临床表现没有特异性，在血友病的诊断中实验室检查尤为重要[5]。
联合多个微卫星DNA位点进行血友病B基因诊断
４ 引物
见表 １由上海 申友 生物技 术 有 限公 司 合 ，
成， 引物 源 自 Ｇ Ｂ库 ， Ｄ 由于扩 增 的 为多 重 Ｐ Ｒ反 应 Ｃ 体系， 故将 大小 相 同的引物 使用 不 同的荧光 标记 。
【 ｅ ｏｌ Ｋ ｙｗ ｒ ￣】 Ｈ ｅ ｏｈｌ ； Ｌ ｋｇ ｎｌ ｉ Ｍｃ￣ ｔｌｅＤ Ａ ａｍ ｐｉ Ｂ ｉ ａ ｉ ａｅａａｙ ｓ ｎ ｓ ； ｉ ． ｅｉ Ｎ ｒａ ｌ ｔ
血 友病 Ｂ是凝 血 因子 Ⅸ （ Ⅸ ） 因 缺 陷 引起 的 Ｆ 基
２ Ｄ Ａ制 备 Ｎ
正常 人及 被检 家 系 成员 基 因组 Ｄ Ａ Ｎ
０８． ．ｏ 个别识别 能力在 ０ ６ ～０９ 。结论 ６ ４ 简便有效的方法。 联 合多个 ＳＲ位点多态性 检测是血友病 Ｂ基 因诊 断的一种 Ｔ
【 关键词 】 血友病 Ｂ 连锁 分析 ； 微 卫星 Ｄ Ａ ； Ｎ
Ｇｎ ｅｅ曲
Ｃｈｎ ｉａ
Ｈ ｎ ＦＮ ， Ａ ＧＫ ．
ｓｏ ｅ ｏ ｈ ｉ ｙｍ ｌｐｅ Ｔ ａａｙｓ ＬｌＸａ￣ａ ，￣ Ａ ｆ ｍ ｐ ｉａＢ ｂ ｕｔｌ Ｓ Ｒ ｎｌｓ ｔ； ｉｎ ｎ ｆ ＇ ｈ ｌ ｉ ｉ ４ Ｇ地 ， 川 ∞ ．Ｃ Ｕ Ｈ Ｈ ｎｌ Ｓｎｇ ａ ｏｇ ．ｈ ｎｈｉ ｉ ｎＨｑｉｌ Ｓａ ｇｎ ｌｓｉ ｅｆＨ ｍ ｔｏｙ Ｓａｇａ ２Ｏ２ ， ｏｊ ，ｈｎｈ ｉｎｔ ｔｏ ｅ ａｏ ｇ ，ｈｎｈｉ ＯＯ５ ｔ ａ ｉ ￣ ／
应用 ＦＲ和 Ｇｎ 删ｎ Ｃ ｅｅ 等方 ￣
【 摘要】 目的 建立简单 、 陕速的血友病 Ｂ遗传学 渗断方法 一方法
法分别检测 ８ ７名正常人和 ８个血友病 Ｂ家系（５ ） ８个 ｍ 位点 的多态性 ， ３人 的 并进行家 系遗传连锁
血友病的基因诊断和产前诊断
患者、患者父母、受检者本人。
② 受检者与患者为姨表亲，需至少六份血样：患者、
患者父母、受检者、受检者父母。（若可提供受
检者外公、外婆血样更利于检测） ③ 患者为受检者外甥：需六份血样：患者、患者父 母、受检者、受检者父母。
家中血友病患者已故，能做携带者基因检测吗？
提供肯定携带者血样（即患者母亲或女儿） 的前提下，可做出约90%血友病基因缺陷的检测。 如无法提供肯定携带者，通过直接基因诊断， 也可以做出90%左右致病基因检测。
什么是产前诊断？
产前诊断又称宫内诊断，是指胎儿出生前采用 各种方法预测其是否有先天性疾病（包括畸形和遗 传性疾病），为能否继续妊娠提供科学依据。
血友病的基因诊断和产前诊断
南方医院妇产科 产前诊断和遗传病诊断技术中心
李莉艳
简介
血友病分甲型、乙型、丙型，还包括因血小板 vWF 因子的缺乏引起的假性血友病。这里主要述及
常见的甲型和乙型血友病。
血友病是X连锁隐性遗传病。
血友病的一般发病率为 1/5 000 ～ 10 000 ( 男
性)，其中约80%为血友病甲。目前我国普遍采用
断。
哪些人需要接受血友病的基因诊断？
直系亲属或母亲家系中有血友病患者的女性，
是临床上血友病基因诊断的主要对象。
血友病患者的女儿是一定的携带者。
为了产前检查的需要，也建议孕前提前进行血
友病相关基因检测，以免延误产前诊断时机。
只做血友病携带者检查，需要哪些人的血样？
按受检者与患者关系不同，分为以下几种情况：
FⅧ:C和FⅨ:C对血友病甲和乙进行诊断和分型。 对血友病这样目前还没有根治手段的遗传病， 鉴定携带者及产前诊断有利于优生优育，可以减 少发病率。 FⅧ 基因庞大，外显子数量多，结构复杂， 且相当部分患者无家族史，这给直接检测基因突 变带来极大不便。
同时存在血友病A及血友病B患者家系的基因诊断
同时存在血友病A及血友病B患者家系的基因诊断陆晔玲;丁秋兰;戴菁;谢炳寿;王明山;奚晓东;王鸿利;王学锋【期刊名称】《诊断学理论与实践》【年(卷),期】2010()5【摘要】目的:对1个同时存在血友病A(HA)及血友病B(HB)患者的家系进行分子发病机制研究,并对家系女性成员进行携带者检测。
方法:采用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fg)、凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性(FⅧ:C)、FⅨ活性(FⅨ:C)及血管性血友病因子(vWF)等测定进行HA及HB表型诊断;用长链聚合酶链反应(LD-PCR)进行F8基因内含子22倒位检测,2组序列特异的PCR对F8基因内含子1倒位进行检测;采用直接核苷酸测序法对F9基因各外显子及其侧翼序列进行检测,联合F9基因相关的6个微卫星位点(DXS8094、DXS1211、DXS1192、DXS102、DXS1227及DXS8013)进行家系遗传连锁分析。
结果:先证者1是由F8基因内含子22倒位引起的HA。
先证者2是由F9基因突变nt32772A→T突变(p.Ser365Cys,GI:22385320)引起的HB,其突变基因遗传自其母亲,来源于先证者2外公的X染色体,其外公为该突变的体细胞和生殖细胞嵌合体,其阿姨口腔细胞DNA未检出该突变。
结论:该家系2名先证者的基因诊断结果与表型诊断相符。
单碱基延伸法可用于突变嵌合率的检测,并为血友病散发家系的突变来源提供可靠的信息。
【总页数】6页(P443-448)【关键词】血友病A;血友病B;嵌合体;基因诊断【作者】陆晔玲;丁秋兰;戴菁;谢炳寿;王明山;奚晓东;王鸿利;王学锋【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科;温州市第三人民医院检验科;温州市第一人民医院检验科;上海交通大学医学院附属瑞金医院临床基因组学国家重点实验室;上海交通大学医学院附属瑞金医院临床上海血液学研究所【正文语种】中文【中图分类】R554.1【相关文献】1.两个特殊血友病A患者家系的基因诊断 [J], 王学锋;戴菁;傅启华;方怡;武文漫;丁秋兰;樊绮诗;王鸿利2.应用两种方法对血友病B家系进行产前基因诊断 [J], 王莉;廖世秀;王应太;姚丰;王涛;康冰3.3个血友病B家系患者与携带者的基因诊断 [J], 蒋雪雯;韦红英;刘壮4.甲型血友病家系的F8基因检测及产前基因诊断 [J], 高云鸽;程天一;赵淑慧;陈必良;杨红;宋婷婷;黎昱;金鑫;张建芳;徐盈因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血友病的诊断标准
血友病的诊断标准血友病，又称为血友病症，是一种遗传性出血性疾病，主要是由于凝血因子Ⅷ或Ⅸ的缺乏或功能异常而导致的。
血友病患者在日常生活中容易出现不同程度的出血症状，严重者甚至可能危及生命。
因此，对血友病的准确诊断至关重要。
本文将介绍血友病的诊断标准，以便临床医生和患者了解如何进行正确的诊断和治疗。
首先，血友病的诊断需要通过详细的病史询问和体格检查。
对于有出血倾向的患者，应该询问其家族史，特别是是否有血友病或其他出血性疾病的家族史。
此外，还需要了解患者的出血症状、出血部位、出血持续时间等情况。
在体格检查中，医生需要注意观察患者皮肤、黏膜等部位是否存在淤血、瘀斑等出血表现。
其次，实验室检查是血友病诊断的重要手段之一。
常规实验室检查包括凝血功能检查、凝血因子活性测定、凝血因子抗原测定等。
凝血功能检查主要包括凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）等指标，这些指标可以反映出患者的凝血功能状态。
凝血因子活性测定和凝血因子抗原测定则可以帮助确定凝血因子Ⅷ或Ⅸ的水平，从而进行血友病的分型。
最后，分子遗传学检查是确诊血友病的金标准。
通过分子遗传学检查可以明确患者的凝血因子基因突变情况，从而确定血友病的遗传类型和突变位点。
这对于家族遗传咨询、产前诊断以及基因治疗等方面具有重要意义。
总之，血友病的诊断需要综合运用病史询问、体格检查、实验室检查和分子遗传学检查等手段。
只有全面深入地了解患者的病情，才能做出准确的诊断和治疗方案。
希望本文能够帮助临床医生和患者更好地了解血友病的诊断标准，提高对该疾病的认识和诊疗水平。
3个血友病B家系患者与携带者的基因诊断
ｂｙ ＰＣＲ，ｔ ｈｅ ｎ ｓ ｅ ｑ ｕｅ ｎｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ａ ｎｇ ｅ ｒ ｄ ｉ ｄ ｅ ｏｘ ｙ ｃ ｈａ ｉ ｎ — ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａ ｔ ｉ ｏｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏｄ ．Ｔｈｅ ｒ ｅ ｓ ｕｌ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙｓ ｅ ｄ ．Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ：
（ Ｇｌ ｙ ２ ３ ６ Ｉ ｌ ｅ ｆ ｓ ＊６ ） ， 家 系 ３中先 证 者 基 因突 变 位 于 第 ７ 号外显子 ， 类型为 ３ ５ ０ ６ ８ — ３ ５ ０ ７ ０ ｄ ｅ １ ３（ Ｖａ １ ２ ６ ３ ｄ ｅ １ ） ， 均 为 未 经 报 道 的 突 变 类
型， 其 中 家 系 ３中 发 现 携 带 者 １例 ， 基 因 突变 类 型 与 家 系 ３中 先 证 者 基 因 突 变 类 型 相 同 。结 论 ： 本 次 基 因 诊 断 为 ３个 家 系 建 立 了家 系 图谱 ， 其 结 果 不 仅 补 充 了血 友 病 Ｂ 的突 变 数 据 库 ， 也 为 血 友 病 Ｂ发 病 的分 子 机 制 提 供 了 一定 分 析 依 据 。
ＨＡＥＭ ｏＰＨＩ ＬＩ Ａ Ｂ
Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｘｕ ｅ ｗｅ ｎ ，Ｗ ｅ ｉ Ｈｏ ｎ ｇ ｙ ｉ ｎ ｇ，Ｌｉ ｕ Ｚ ｈ ｕ ａ ｎ ｇ ．（ Ｐｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ ｉ ｃ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｆｉ ｒ ｓ ｔ Ａｆ ｆ ｉ ｔ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ
血友病基因诊断的研究现状
Ｆ 以轻链 和重链 的 异 二 聚 体 形 式 存 在 ， 链 由 Ａ。 Ⅷ 轻 一
Ｃ 一！组 成 。 链 由 Ａ 一 一 组 成 ， 者 通 过 Ｃ Ｃ 重 Ａ Ｂ 两 相 连 接 。 在 ＦⅧ 的 活 化 过 程 中 ， 结 构 区 被 水 解 ， 成 Ｂ 形 ２个 肽 链 。 经 凝 血 酶 活 化 生 成 有 活 性 的 Ｆ 。 再 Ⅷ ２ 因子 Ⅸ 的基 因结 构 ｌ ． ２
区 。 Ａ 一 一 Ａ。 （ 以 Ａ： 一 一＝ 方 式 排 列 。 ３个 重 复 的 Ａ Ｃ Ｌ ＝ ２的
可联 合 应 用 表 １中 所 述 方 法 进 行 血 友 病 基 因
突 变 的 检测 。
表 １中列 出 了有 关 检 测 血 友 病 基 因 突 变 的 方
法 ， 内 已 建 立 。 因 各 种 方 法 都 有 其 局 限 性 ， 以 国 所
律 。８个 外 显 子 长 度 从 ２ ｂ ５ ｐ至 １ ３ ｂ ５ ｐ不 等 ， 中 ９ 其 包 括 以 下 ６个 主 要 结 构 域 ： 号 肽 和 前 肽 区 、 羧 信 一 基 谷氨 酸结 构 区 、 ２个 类 表 皮 生 长 因 子 区 、 化 肽 活 区 和催 化 区 。 现 已 使 用 牛 ＦⅨ ｃ ＤＮＡ 寡 核 苷 酸 探 针 进 行 基 因 分 子 克 隆 及 ＤＮＡ 测 序 ， 得 人 类 ＦⅨ 获
Ａ 为 １９ ～ ２４／ Ｏ ， 友病 Ｂ为 ｏ ３ ～ ｏ４ ／Ｏ 。 ． ． ０ ｌ 血 ． ２ ．４ ｌｊ 据 我 国 ｌ 所 大 型 医 院 截 止 １９ ｌ ９ ９年 底 统 计 ， 友 病 血 共 计 ４６ ５例 ， 中 血 友 病 Ａ ３ ９ ５ 其 ９例 （ ８ ） 血 友 ９ 占 ６ ，
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1
2 282 280
340
346 340
172
172 172
374
365 374
II 1
4
319 325
325
218 220
212
150 150
130
282 280
280
III
340 340
172 172
1 340 172
374 374 325 325 374
220 212
150 130
280 280
15
ST14 DXS15 DXS9901
G6PD
DXS1073 F8
F8
CA22
F8Civs13
DXS1108
DXS8069 DXS1073
3-486 Intron25 F8Civs13
5-147 5-226
16
结果与讨论
Marker 5_226 5_147 DXS8069 3_486 INTRON25
340 340
172 172
374 374
2
319 325 218 220 150 150 282 280 340 340 172 172 374 374
HA患者
胎儿
3 323 212 150 282 346 172 365
间接诊断结果
ca13 基因扫描
III-1 表姐：144/144 III-2待检者： 142/142 II-3母亲：142/144 II-2舅妈：140/144
26
II-4父亲：142/-
间接诊断结果
ca22基因扫描
III-1 表姐：79/79 III-2待检者：79/83 II-3母亲：83/79 II-2舅妈：79/79 II-4父亲：79/-
杂合度 72.46% 49.27% 72.46% 49.27% 31.88%6
54.84%
6
64.52%
6
58.06%
3
41.94%
联合5个STR位点可对所有要求做携带者及产前诊断 的血友病A家系提供遗传连锁分析结果且与F8基因直接 检测结果相符
17
结果与讨论
DXS8069 DXS1073
40.1 12.5 20.65 1.9
164
119
基因检测结果
F8内含子22倒位 F8内含子1倒位
先证者 阳性（携带者） 阴性
胎儿 阴性
阴性
其他人 阴性
阴性
• 先证者F8基因所有外显子及其侧翼序列扩增测序 （-）
31
遗传连锁分析
319
323 325
218
212 220
I
150
150 150
282
7重荧光PCR技术
3-486
降低重组发生率
F8
Intron25
F8Civs13 未见漏诊和误诊
5-147
5-226
诊断率和准确率100％
18
特殊血友病A家系的基因诊断
• 先证者自幼皮肤、头颅撞伤后及拔牙及手术后有 出血难止，曾发生过颅内出血
• BT、PT正常 • APTT延长，FVIII:C 2% • 输注全血或抗血友病球蛋白治疗有效 • 先证者已故
20
FVIII:C 2%
21
直接基因测序
• 结果：
直接测序未检测出突变。
• 原因：
据文献报道FVIII直接基因测序有1%-10% 的患者查不到基因突变
（ Hum Mutat. 2002 Oct;20(4):26774）
突变可能在内含子中
可能存在大的缺失
22
携带者诊断结果
携带者及待检者
F8内含子22倒位
27
血友病A携带者间接诊断结果分析
舅舅 表姐
舅妈
父亲
综合A13、CA22及 Bcl I 信息，待检者与 其表姐有不同的X染 色体。
母亲 待检者 28
女性血友病A的基因及产前诊断
标本来源
先证者（II-1），女，21岁，汉族，自幼有踝关 节及膝关节有自发出血，临床诊断为血友病A， 冷沉淀及浓缩FVIII输注有效，因怀孕要求作基因 诊断及产前诊断
I-1
APTT PT TT
s
s
s
Fg vWF FVIII ：C
g/L %
%
28.9 11.3 17.7 3.3
141
121
？ ？
I-2
27.2 10 18.6 2.4
124
118
II-1
75.2 12.1 17.7 2.1
121
2. 1
II-2
39 11.5 18.8 2.8
142
107
30
II-3
均为阴性
23
间接诊断结果
BclI酶切图 III-1表姐： -/II-2舅妈： -/II-3母亲： +/II-4父亲： +/+ III-2待检者：+/+
M 24
BclI酶切图测序图
BclI酶切识别位点
T/GATCA
a
图a 待检者测序图， 含BclI酶切位点
图b 表姐测序图，不
含BclI酶切位点
b
25
①、 ② 、③
8
血友病A
间接基因诊断
• 第一代标志
F8基因内的BclⅠRFLP F8基因内两个STR位点 F8基因外的St14 VNTR
10
家系15 Bcl I RFLP位点多态性连锁分析
11
家系13 st14位点VNTR多态的基因连锁分 析
12
内含子13中STR多态位点用于家系12基因连锁分 析
13
第二代标志
• 6个与F8 紧密连锁的STR位点： DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073和
DXS1108 距F8 1.5Mb内 1个F8 内的STR位点(F8Civs13) • 性别位点为牙釉蛋白基因（Amelogenin gene） 终产物 X染色体102bp，Y染色体 108bp
3
内含子22倒位
4
结果（1）
内含子22 倒位检测结果 5
内含子1倒位机制
6
内含子1倒位检测方法
2Kb 1.5Kb
2Kb 1.5Kb
7
血友病携带者和产前诊断流程
外周血DNA抽提（携带者） 羊水DNA抽提（胎儿）
PCR扩增
长链PCR检测内含子1,22倒位
①
直接核酸测析
间接联锁分析
③
②
明确诊断
血友病A
14
第三代位点的开发
• 对象：69名正常女性、31个血友病A家 系（120名相关成员）
• 方法：在人类基因组数据库中选择了位 于F8基因两端0.5CM内的三个STR位点 （5_226、5_147及3_486），F8基因内 的1个STR位点（INTRON25）及距离F8 基因2CM内的DXS8069位点，以多重荧 光PCR法检测5个微卫星位点的多态性
血友病的基因诊断
1
背景
血友病A 10～20/10万，绝对患病数约13～26万（中国） 无完整的诊断体系，误诊、漏诊、病死率高 替代治疗：传播疾病，经济负担重
感染HCV， HBV，HIV，$14万/年/人（美国 ) 致死（残）率极高 遗传后代
2
p
血友病A、B
q
X染色体
FIX (Xq27) FVIII (Xq28)